程序性死亡分子1及其配體在口腔鱗狀細(xì)胞癌患者外周血中的表達(dá)及臨床意義

張鵬 歐陽少波 王軍 黃自坤 王嬌龍 廖嵐

1.南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔頜面外科；3.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南昌 330006

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC，以下簡(jiǎn)稱口腔鱗癌）是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)[1]。研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞可通過免疫逃逸使腫瘤免受宿主防御機(jī)制的殺傷[2]。近年來，共刺激分子在腫瘤免疫應(yīng)答中的作用備受關(guān)注[3-5]，其中，新近發(fā)現(xiàn)的B7家族共刺激分子程序性死亡分子配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）已被證實(shí)是介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的重要分子之一。PD-L1與其受體程序性死亡分子1（programmed death-1，PD-1）結(jié)合后介導(dǎo)的負(fù)性信號(hào)可抑制T淋巴細(xì)胞的激活、增殖及細(xì)胞因子的分泌，消弱宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[6]。Tsushima等[7]及Cho等[8]研究發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)升高。隨后的研究[9]中，PD-1/PD-L1與口腔鱗癌的相互關(guān)系倍受關(guān)注，但口腔鱗癌患者外周血中PD-1/PD-L1變化情況及其與口腔鱗癌諸多臨床病理特征的關(guān)系尚不清楚。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)口腔鱗癌患者及健康對(duì)照者外周血T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量及CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1/PD-L1的表達(dá)水平，通過酶聯(lián)免疫吸附方法檢測(cè)血清中可溶性PD-1（soluble PD-1，sPD-1）和可溶性PD-L1（soluble PD-L1，sPD-L1）的表達(dá)水平，從而探討PD-1/PD-L1途徑在口腔鱗癌中的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2010年8月—2013年10月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔頜面外科收治的口腔鱗癌患者82例為口腔鱗癌組，其中，男48例，女34例；年齡30～72歲，中位年齡57歲。納入要求：口腔鱗癌患者術(shù)前未進(jìn)行過化療、放療或其他生物治療，且無全身性免疫系統(tǒng)疾病。鱗癌原發(fā)灶及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶均由南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科確診，其中舌癌36例，牙齦癌22例，頰黏膜癌13例，唇癌7例，腭癌4例；TNM分期，Ⅰ+Ⅱ期52例，Ⅲ+Ⅳ期30例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移61例。對(duì)照組為同期本院體檢中心性別、年齡匹配的健康體檢者25例，其中男15例，女10例；年齡28～70歲，中位年齡54歲。本研究中所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器

異硫氰酸熒光素標(biāo)記的CD4抗體（fluorescein isothiocyanate-CD4，F(xiàn)ITC-CD4）、藻紅蛋白（phycoerythrobilin，PE）-Cy5標(biāo)記的CD8抗體（PE-Cy5-CD8）、藻紅蛋白-得克薩斯紅（energy coupled dye，ECD）標(biāo)記的CD3抗體（ECD-CD3）（Beckman Coulter公司，美國(guó)），PE標(biāo)記的鼠抗人PD-1（PE-PD-1）、PD-L1（PE-PD-L1）抗體及各種同型對(duì)照IgG抗體（eBioscience公司，美國(guó)），酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒Human-sPD-1 Kit和Human-sPD-L1 Kit（R&D公司，美國(guó)），Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter公司，美國(guó)），酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本的收集及處理 所有研究對(duì)象均為清晨空腹采血，用普通促凝真空采血管和EDTA-K2抗凝真空采血管采靜脈血（外周血）各2 mL。EDTA-K2抗凝血標(biāo)本置4 ℃保存，6 h內(nèi)送檢；促凝血室溫靜止30 min，3 000 r·min-1離心5 min后取上清液，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 取2支流式細(xì)胞分析管，其中一支加入熒光素標(biāo)記單抗ECD-CD3、FITC-CD4和PE-Cy5-CD8各5 μL，另外一支加入相應(yīng)同型對(duì)照IgG抗體。在兩支試管中各加入EDTA-K2抗凝血50 μL，室溫避光孵育15 min，加入經(jīng)10倍稀釋的溶血素200 μL，靜置10 min后，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清，加生理鹽水洗滌細(xì)胞2次，棄上清，用生理鹽水重懸經(jīng)Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.3 T淋巴細(xì)胞表面PD-1、PD-L1表達(dá)的檢測(cè) 取3支流式細(xì)胞分析管，其中一支加入熒光素標(biāo)記單抗FITC-CD4、PE-Cy5-CD8和PE-PD-1各5 μL，一支加入FITC-CD4、PE-Cy5-CD8和PE-PD-L1各5 μL，另外一支中加入相應(yīng)同型對(duì)照 IgG 抗體。兩支試管中各加EDTA-K2 抗凝血50 μL，室溫避光孵育15 min，加入經(jīng)10倍稀釋的溶血素200 μL，靜置10 min后，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清，加生理鹽水洗滌細(xì)胞2次，棄上清，用生理鹽水重懸經(jīng)Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.4 血清sPD-1、sPD-L1表達(dá)的檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清sPD-1、sPD-L1的含量，操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。簡(jiǎn)要操作步驟如下：將sPD-1、sPD-L1標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋，在96孔板中分別加入100 μL血清樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，室溫孵育2 h，清洗液洗2次，然后加入100 μL酶標(biāo)二抗室溫孵育2 h，清洗液洗2次，加入100 μL顯色劑避光孵育20 min，反應(yīng)結(jié)束后加入50 μL終止液，酶標(biāo)儀讀取450 nm吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算血清sPD-1、sPD-L1的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)性檢驗(yàn)，各組檢測(cè)值均符合正態(tài)分布且方差齊，兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，三組間用單因素方差分析，兩兩間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。口腔鱗癌患者CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)比值與外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1陽性表達(dá)率的相關(guān)性應(yīng)用Pearson相關(guān)進(jìn)行分析。將口腔鱗癌患者按臨床病理參數(shù)（性別、年齡、腫瘤部位、大小、臨床分期、分化程度及頸淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移）進(jìn)行分組，應(yīng)用Pearson相關(guān)分析口腔鱗癌患者血清中sPD-L1水平、PD-1的陽性T細(xì)胞百分率與臨床病理特征的關(guān)系。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 口腔鱗癌組與對(duì)照組外周血T淋巴細(xì)胞亞群的比較

口腔鱗癌組與對(duì)照組外周血T淋巴細(xì)胞亞群的比較結(jié)果見表1?？谇击[癌組外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)及CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)比值均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；口腔鱗癌組CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)則高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表1 口腔鱗癌組與對(duì)照組外周血T淋巴細(xì)胞亞群的水平Tab 1 The expression of peripheral blood T lymphocyte subsets from OSCC group and control group

2.2 口腔鱗癌組與對(duì)照組外周血T淋巴細(xì)胞表面PD-1、PD-L1的表達(dá)水平

口腔鱗癌組與對(duì)照組CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1及PD-L1的表達(dá)水平見表2?？谇击[癌患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1、PD-L1的表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.3 口腔鱗癌患者CD4+/CD8+ T淋巴細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)比值與外周血CD4+、CD8+ T淋巴細(xì)胞表面PD-1陽性表達(dá)率的相關(guān)性

相關(guān)分析結(jié)果顯示，口腔鱗癌患者CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)比值與外周血CD4+T淋巴細(xì)胞表面PD-1的陽性表達(dá)率相關(guān)（r=0.446，P<0.01），與CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1的陽性表達(dá)率不相關(guān)（P＞0.05）。

2.4 口腔鱗癌組與對(duì)照組血清中sPD-1、sPD-L1的表達(dá)水平

口腔鱗癌組與對(duì)照組血清中sPD-1、sPD-L1的表達(dá)水平見表3。口腔鱗癌組血清sPD-L1水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而sPD-1水平二者的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)口腔鱗癌患者CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)比值與患者血清sPD-L1水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，口腔鱗癌患者CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)比值與患者血清sPD-L1水平相關(guān)（r=0.353，P<0.01）。

表2 口腔鱗癌組與對(duì)照組CD4+、CD8+ T淋巴細(xì)胞表面PD-1及PD-L1的水平Tab 2 The expression of PD-1 and PD-L1 in CD4+, CD8+T cells from OSCC group and control group

表3 口腔鱗癌組與對(duì)照組血清中sPD-1、sPD-L1的水平Tab 3 The expression of sPD-1 and sPD-L1 in serum from OSCC group and control group

2.5 口腔鱗癌患者血清中sPD-L1含量與患者臨床病理特征的關(guān)系

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，sPD-L1的表達(dá)與臨床分期、細(xì)胞分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)（P<0.05）。Ⅲ+Ⅳ期患者血清sPD-L1水平（450.2 pg·mL-1±85.2 pg·mL-1）高于Ⅰ+Ⅱ期患者（414.0 pg·mL-1±83.4 pg·mL-1）（P<0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清sPD-L1水平（483.3 pg·mL-1±79.3 pg·mL-1）高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（399.7 pg·mL-1±84.8 pg·mL-1）（P<0.01）；低分化患者血清sPD-L1水平（495.8 pg·mL-1±86.5 pg·mL-1）高于中高分化患者（382.4 pg·mL-1±82.6 pg·mL-1）（P<0.01）。血清sPD-L1含量與性別、年齡、腫瘤部位及大小無相關(guān)性（P>0.05）。

2.6 口腔鱗癌患者PD-1的陽性T細(xì)胞百分率與患者臨床病理特征的關(guān)系

相關(guān)性分析表明，口腔鱗癌患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)水平均與腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)。低分化患者的外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)水平高于中高分化患者（P<0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P<0.05）?？谇击[癌患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)水平與臨床分期、性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位無關(guān)（P>0.05）。

3 討論

腫瘤免疫主要依靠細(xì)胞免疫，其中，T淋巴細(xì)胞處于核心地位，在免疫監(jiān)視、殺傷靶細(xì)胞及免疫調(diào)節(jié)方面具有極重要的作用。由于T淋巴細(xì)胞各亞型在抗腫瘤免疫中所起作用不同，因此，檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群是反映機(jī)體抗腫瘤狀態(tài)的重要指標(biāo)之一。本研究表明，口腔鱗癌患者外周血淋巴細(xì)胞免疫亞型比例與健康人相比存在異常，CD3+、CD4+及CD4+/CD8+百分率較對(duì)照組降低，CD8+較對(duì)照組升高，與李向春等[10]報(bào)道結(jié)果一致，說明口腔鱗癌患者體內(nèi)存在細(xì)胞免疫功能失衡的微環(huán)境。

在T細(xì)胞的活化和增殖過程中，除了需要T細(xì)胞受體與表達(dá)在抗原遞呈細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）-抗原肽復(fù)合物結(jié)合產(chǎn)生的第一信號(hào)外，還需要共刺激分子與受體結(jié)合產(chǎn)生的第二信號(hào)的參與[6]。PD-1及其配體PD-L1是新近發(fā)現(xiàn)的負(fù)性共刺激信號(hào)分子，PD-L1與PD-1結(jié)合后可有效抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，負(fù)向調(diào)控免疫應(yīng)答，從而減弱機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，該信號(hào)途徑在腫瘤免疫中的地位已經(jīng)備受關(guān)注。劉書漫等[11]報(bào)道PD-L1和PD-1在胃癌組織中表達(dá)升高，且PD-L1表達(dá)與胃癌的浸潤(rùn)深度、周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。Hua等[12]研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在人結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)和胞漿中，結(jié)腸癌患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上PD-1表達(dá)升高，其推測(cè)阻斷 PD-1/PD-L1途徑可作為治療結(jié)腸癌的一個(gè)新靶點(diǎn)。近年來，在口腔鱗癌免疫逃逸機(jī)制的諸多研究中，有研究結(jié)果表明口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展可能與PD-1/PD-L1信號(hào)途徑有密切關(guān)系。Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn)，γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）可通過蛋白激酶D2（protein kinase D isoform 2，PKD2）信號(hào)途徑對(duì)人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113上PD-L1表達(dá)有明顯促進(jìn)作用。盧禮兵等[13]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中炎癥細(xì)胞因子可以促進(jìn)Tca8113表達(dá)PD-L1。為深入研究PD-1/PD-L1信號(hào)途徑與口腔鱗癌的關(guān)系，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了82例口腔鱗癌患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1及PD-L1的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，口腔鱗癌患者CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1及PD-L1的表達(dá)均明顯升高（P<0.05），與Malaspina等[14]的結(jié)果一致，說明PD-1/PD-L1信號(hào)途徑與口腔鱗癌的發(fā)生及發(fā)展關(guān)系密切。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌患者CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)比值與外周血CD4+T淋巴細(xì)胞表面PD-1的陽性表達(dá)有關(guān)（P<0.01）。進(jìn)一步分析患者PD-1陽性T細(xì)胞百分率與性別、年齡、腫瘤部位、病理、大小、臨床分期、分化程度及頸淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移的關(guān)系，結(jié)果顯示，口腔鱗癌患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)（P<0.05），與臨床分期、性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位無關(guān)（P>0.05）。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，共刺激分子除了可以在細(xì)胞膜上表達(dá)（膜型）外，還可以呈可溶性形式存在于血清中，即可溶性共刺激分子?，F(xiàn)已證明，這類可溶性的共刺激分子能夠像細(xì)胞膜表面的分子一樣以相同的方式與受體相互作用發(fā)揮一定的生物學(xué)功能。研究顯示，可溶性的共刺激分子能夠像細(xì)胞因子一樣參與血液循環(huán)，不但可以影響鄰近細(xì)胞，而且也能和遠(yuǎn)端細(xì)胞表面的受體相互結(jié)合從而發(fā)揮廣泛的抑制效應(yīng)，其發(fā)揮作用的廣度和深度可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過細(xì)胞膜表面的膜型共刺激分子，因此，可溶性共刺激分子在疾病發(fā)生和發(fā)展過程中的作用引起了研究者的高度關(guān)注[15-16]。臨床研究顯示，人血清中也同樣存在sPD-1和sPD-L1分子，其中，sPD-L1是由金屬蛋白酶剪切細(xì)胞表面膜型PD-L1而成，人外周血中存在的sPD-L1能促進(jìn)PD-1/PD-L1負(fù)性信號(hào)，從而參與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。邢玉斐等[17]研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者外周血清中sPD-L1的表達(dá)異常增高，且與肺癌的分期、轉(zhuǎn)移和療效有關(guān)，這有助于判斷肺癌患者的預(yù)后。

迄今為止，尚未有關(guān)于口腔鱗癌可溶性共刺激分子表達(dá)情況的報(bào)道，為進(jìn)一步深入研究sPD-1/sPDL1與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，本研究采用ELISA技術(shù)檢測(cè)了口腔鱗癌患者和健康對(duì)照人群血清中sPD-1和sPD-L1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，口腔鱗癌患者血清中sPD-L1異常增高。對(duì)口腔鱗癌患者CD4+/CD8+T百分?jǐn)?shù)比值與患者血清sPD-L1水平的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，口腔鱗癌患者CD4+/CD8+T百分?jǐn)?shù)比值與患者血清sPD-L1水平有關(guān)（P<0.01）。在分析sPD-L1表達(dá)水平與口腔鱗癌多種臨床病理特征的關(guān)系中可以發(fā)現(xiàn)，sPD-L1的表達(dá)與臨床分期、腫瘤細(xì)胞分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)。Ⅲ+Ⅳ期患者血清中的sPD-L1表達(dá)水平明顯高于Ⅰ+Ⅱ期患者，低分化患者的sPD-L1表達(dá)水平高于中、高分化患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的sPD-L1表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。本研究中未發(fā)現(xiàn)sPD-L1表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位有關(guān)。

綜上所述，口腔鱗癌患者體內(nèi)T細(xì)胞免疫處于抑制狀態(tài)，外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1/PD-L1的表達(dá)上調(diào)，口腔鱗癌患者血清中sPD-L1異常升高，且與臨床分期、腫瘤細(xì)胞分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)有關(guān)。本研究表明，特異性阻斷PD-1/PD-L1抑制途徑有望成為腫瘤靶向治療的策略之一。

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