肉雞鸚鵡熱衣原體病原微生物的實(shí)驗(yàn)室分離鑒定

段延軍 張小麗

(1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院730070；2中農(nóng)威特生物科技股份有限公司730000)

衣原體病是由衣原體（Chlamydia）引起畜禽、野生動(dòng)物和人類(lèi)發(fā)生感染以流產(chǎn)、肺炎、支氣管炎、胃腸炎、結(jié)膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦脊髓炎為主要病理特征的疾病。鸚鵡熱衣原體?。ˋA Chlamydiosis，AC）是一種接觸性傳播的人獸共患。在自然條件下肉雞可以感染本病，表現(xiàn)出沉郁、呼吸困難、食量下降，常呈惡病質(zhì)狀態(tài)，最終因衰竭而導(dǎo)致死亡，耐過(guò)的病雞表現(xiàn)生長(zhǎng)受阻[1]。本研究采集某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)疑似鸚鵡熱衣原體病的組織病料，進(jìn)行病原微生物的分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

病雞：采集某養(yǎng)殖場(chǎng)肉雞群；SPF雞胚購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑

衣原體單克隆熒光抗體診斷試劑盒（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物檢驗(yàn)研究中心）；

衣原體病間接血凝（IHI）診斷試劑盒（湖北畜牧獸醫(yī)研究所）；

姬姆薩染液；碘染液。

1.3 方法

1.3.1 血清學(xué)檢測(cè)

采取疑似鸚鵡熱衣原體病肉雞血清，使用衣原體病間接血凝試驗(yàn)診斷試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)，根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)判斷血凝反應(yīng)程度。

1.3.2 樣品采集

根據(jù)病雞臨床癥狀和病理變化，取病變嚴(yán)重的肺臟、肝臟、氣管、腎臟、心臟等病料，分為兩份，一份用于雞胚接種，一份用于臟器壓片和細(xì)菌培養(yǎng)。

1.3.3 臟器壓片檢查

取采集的病料組織作壓片后使用姬姆薩染色，鏡檢，觀察包涵體。

1.3.4 細(xì)菌培養(yǎng)

將采集的病料組織接種于普通瓊脂、麥康凱瓊脂和血液瓊脂培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，挑取疑似菌落，涂片染色鏡檢，生化鑒定。

1.3.5 SPF雞胚接種和傳代

無(wú)菌采集明顯臨床癥狀病雞的肺臟組織，充分研磨后加入200ug/ml鏈霉素，50ug/ml慶大霉素，100ug/ml萬(wàn)古霉素，加入生理鹽水制成20%混懸液，2000r/min離心10min，取上清接種于7日齡SPF雞胚卵黃囊腔中，0.3ml/枚，37℃孵育，逐日觀察雞胚病變情況，棄去3d內(nèi)發(fā)生死亡的雞胚，取4-6d死亡的雞胚卵黃囊，壓片，用熒光抗體標(biāo)記的抗衣原體單克隆抗體染色，鏡檢衣原體的包涵體。

將分離培養(yǎng)的卵黃囊膜做涂片，甲醇固定3min，碘染色溶液染色10min，水洗，吸干，油鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀和病理剖檢

病雞多呈隱形經(jīng)過(guò)，食欲減退，精神沉郁，漸進(jìn)性消瘦，呼吸困難，頻繁張嘴呼吸，喜蹲臥，眼臉腫脹，流淚，鼻孔內(nèi)流出大量膿性或漿液性鼻液。剖檢發(fā)現(xiàn)病變主要集中在肺臟、氣囊、肝臟和腎臟上，重癥者肺臟出現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)纖維素性滲出物，肺邊緣粘連，單側(cè)或雙側(cè)氣囊混濁，肝臟顏色變淡，偶爾發(fā)現(xiàn)壞死灶，后期出現(xiàn)肝周炎，氣管喉頭有大量粘液，腎臟腫大出血。

2.2 血清學(xué)檢測(cè)

本次共采集疑似鸚鵡熱衣原體病雞血清81份，血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，臨床上15～20日齡的肉雞最乙肝，死亡雞群主要集中在30～39日齡，發(fā)病率30%左右，死亡率10%左右，病程長(zhǎng)約14～20d。

2.3 肺臟壓片檢查

在熒光顯微鏡下課見(jiàn)與抗衣原體熒光單克隆抗體反應(yīng)，觀察到亮綠色衣原體包涵體。

2.4 細(xì)菌培養(yǎng)

在普通培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)一些無(wú)色光滑、顆粒樣菌落，麥康凱培養(yǎng)基上長(zhǎng)出亮紅色，向培養(yǎng)基內(nèi)凹生長(zhǎng)的菌落，經(jīng)染色鏡檢和生化鑒定，生長(zhǎng)出的菌落為大腸桿菌。

2.5 SPF雞胚接種

盲傳三代4～6d規(guī)律性死亡的雞胚胚體充血、出血，雞胚頭、頸、背部出現(xiàn)明顯的出血斑，卵黃膜變薄，尿囊液清澈，囊膜水腫，取雞胚卵黃囊膜壓片，經(jīng)熒光抗體標(biāo)記的抗衣原體單克隆抗體染色后再熒光顯微鏡下可以觀察到亮綠色熒光圓形顆粒，可判斷為衣原體感染陽(yáng)性。

3 討論

國(guó)外許多學(xué)者認(rèn)為雞對(duì)鸚鵡熱衣原體具有一定的抵抗力，自然感染的雞常呈隱形或一過(guò)性感染，很難分離到衣原體，而且血清學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性率比較低，幼雞急性感染后可能出現(xiàn)死亡。后來(lái)有學(xué)者報(bào)道，由于雞衣原體IHI抗體應(yīng)答發(fā)生比較遲，雞衣原體實(shí)際感染率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血清學(xué)陽(yáng)性檢出率[2]。本研究對(duì)某肉雞場(chǎng)疑似鸚鵡熱衣原體病雞血清進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該肉雞場(chǎng)感染情況普遍發(fā)生，發(fā)病率在25～30%左右，死亡率在10%左右，調(diào)查結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]。

在雞胚接種過(guò)程中，不同來(lái)源和不同批次的SPF雞胚對(duì)同一鸚鵡熱衣原體的敏感性不同，引發(fā)雞胚致死率也有差異。研究結(jié)果顯示，該菌株在細(xì)菌培養(yǎng)基上不聲張，使用姬姆薩和熒光標(biāo)記抗衣原體單克隆抗體染色接種雞胚卵黃囊膜，在熒光顯微鏡下可以看到衣原體顆粒。在本次菌株分離的過(guò)程中還分離到了大腸桿菌，因此在臨床上診斷時(shí)要注意鸚鵡熱衣原體和大腸桿菌病混合感染的情況，并注意做出鑒別診斷。

[1]唐國(guó)芳,陳麗麗,劉良專(zhuān),等.鸚鵡熱嗜衣原體禽鳥(niǎo)株的分離鑒定及小鼠呼吸道感染模型的建立[J].微生物學(xué)報(bào),2010,50(12):1657-1663.

[2]石巖,何誠(chéng),朱虹,等.肉雞鸚鵡熱衣原體的分離和鑒定[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2003,13(4):217-220.

[3]王爭(zhēng)強(qiáng),朱虹.鸚鵡熱嗜衣原體檢測(cè)和診斷方法研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2005,33(2):75-78.