辣椒疫霉產(chǎn)孢能力與致病力的相關(guān)性分析

李 萍，張茜茹，吳 亞，高智謀*

(1.安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林園藝系，安徽安慶 246003;2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，安徽合肥 230036)

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)是一種重要的植物病原卵菌，常威脅茄科、葫蘆科和豆科等多種農(nóng)作物的生產(chǎn)，給全世界蔬菜產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重危害［1－2］。該病菌廣泛分布于北京、上海、湖南、安徽、甘肅、新疆、陜西、青海、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、山東、云南、臺(tái)灣、湖北、海南等地，并在江蘇、浙江、安徽、上海等長(zhǎng)江中下游地區(qū)造成嚴(yán)重?fù)p失［3－7］。由辣椒疫霉引起的辣椒疫病成為我國(guó)辣椒主產(chǎn)區(qū)嚴(yán)重病害［8］，辣椒疫病發(fā)生時(shí)，葉片、果實(shí)和莖部均可受害，引起呈暗綠色水漬狀，濕度大時(shí)產(chǎn)生白色菌絲層，最后壞死［9］。

辣椒疫霉主要以卵孢子和厚垣孢子在土壤中或殘留在地上的病殘?bào)w內(nèi)越冬，作為來(lái)年病害發(fā)生的初侵染源。卵孢子在土中病殘?bào)w內(nèi)可以存活3年，條件適宜時(shí)，卵孢子可萌發(fā)并侵染寄主植物的根系或地下部分，或者萌發(fā)后產(chǎn)生孢子囊，孢子囊釋放出游動(dòng)孢子，經(jīng)雨水或灌溉水傳播至植物地上莖、葉及果實(shí)上引起發(fā)病。在合適條件下，辣椒疫霉侵入辣椒等寄主后通常在幾天內(nèi)就可在病部表面產(chǎn)生大量孢子囊并釋放出游動(dòng)孢子，成為再侵染源，借助風(fēng)和雨水或帶病的種苗、土壤及灌溉水進(jìn)行傳播［10］。因此，游動(dòng)孢子囊的產(chǎn)量是辣椒疫病發(fā)生流行的必要條件，但有關(guān)辣椒疫病發(fā)病程度與游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量的關(guān)系尚未見報(bào)道。為此，筆者研究了游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量與辣椒疫霉對(duì)辣椒的致病力關(guān)系，從生物學(xué)特性方面探討了辣椒疫霉的致病力分化機(jī)制，從統(tǒng)計(jì)學(xué)上剖析了致病力分化與游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量的關(guān)系，旨在為該病害的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試作物。辣椒品種為“艷陽(yáng)”。

1.1.2 供試培養(yǎng)基。胡蘿卜培養(yǎng)基(CA)［11］:將200 g新鮮胡蘿卜切成小片，加去離子水500 ml，煮沸后計(jì)時(shí)30 min，用雙層紗布過濾去渣，補(bǔ)水至1 000 ml，加入瓊脂20 g，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。10%V8培養(yǎng)液:100 ml V8汁加入1 g CaCO3，1 500 r/min 離心10 min，上清液與去離子水按1∶9的比例稀釋，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 供試菌株的分離及其致病力測(cè)定。2006～2010年在安徽淮南(HN)、合肥(HF)、潛山(QS)、岳西(YX)、和縣(HX)、石臺(tái)(ST)、銅陵(TL)、阜陽(yáng)(FY)和亳州(BZ)等縣(市)辣椒上采集辣椒疫病病株，采用組織分離法，使用選擇性培養(yǎng)基對(duì)病原菌進(jìn)行分離，共獲得56個(gè)分離物，分離獲得的培養(yǎng)物經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后，單孢分離并保存。采用活體刺莖接種法測(cè)定辣椒疫霉不同菌株對(duì)辣椒的致病力。

1.2.2 游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量測(cè)定。參照陳方新等［12］的方法，將供試菌株移至CA上，25℃黑暗培養(yǎng)3 d，用打孔器(d=4 mm)沿菌落邊緣打取菌碟，分別放入含15 ml的10%V8培養(yǎng)液中，每皿4塊菌碟，每菌株3次重復(fù)。25℃黑暗培養(yǎng)72 h后，傾去培養(yǎng)液，加入15 ml無(wú)菌水，隔12 h后再換一次無(wú)菌水，24 h后將產(chǎn)生大量孢子囊的3次重復(fù)混合，3 000 r/min勻漿1 min，勻漿后用無(wú)菌水定容至50 ml，加入0.05%的吐溫80，經(jīng)磁力攪拌器攪拌充分混勻后，分別配制成孢子囊懸浮液。用微量加樣器吸取5 μl懸浮液于載玻片上拉出1條水帶，置于10×10倍顯微鏡下計(jì)數(shù)游動(dòng)孢子囊數(shù)目。

1.2.3 游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量與致病力的相關(guān)性分析。畫出辣椒疫霉游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量與其致病力的散點(diǎn)圖及擬合的線性圖，計(jì)算相關(guān)系數(shù)(r)，根據(jù)相關(guān)系數(shù)大小分析相關(guān)程度:r＜0，負(fù)相關(guān);r=0，無(wú)線性相關(guān);︱r︱ ＞0.95，顯著性相關(guān);︱r︱＞0.80，高度相關(guān);0.50≤︱r︱ ＜ 0.80，中度相關(guān);0.30≤︱r︱ ＜0.50，低度相關(guān);︱r︱ ＜0.30，關(guān)系極弱，認(rèn)為不相關(guān)。在P＜0.05水平上有顯著性差異表明有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 56個(gè)供試菌株的致病力測(cè)定結(jié)果 56個(gè)供試菌株接種辣椒莖稈后均可引起發(fā)病，但不同菌株所致病斑的平均長(zhǎng)度有顯著差異(表1)。

表1 辣椒疫霉不同菌株對(duì)辣椒植株的致病力測(cè)定結(jié)果

2.2 安徽省辣椒疫霉游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量 安徽省不同地區(qū)的辣椒疫霉菌株在10%V8培養(yǎng)液中均可產(chǎn)生游動(dòng)孢子囊且產(chǎn)量存在極顯著差異(表2)。游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量最大的是亳州菌株BZ8，達(dá)1.37×104個(gè)/ml。合肥菌株 HF2和HF7的游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量最小，僅為2.70×102個(gè)/ml。在56個(gè)菌株中，有39個(gè)菌株的游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.6×103個(gè)/ml，占總數(shù)的69.64%;有14個(gè)菌株的游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.61 ×103～0.90 ×103個(gè)/ml，占 25.00%;有3 個(gè)菌株的游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.91×103～0.99×103個(gè)/ml，占5.36%，表明辣椒疫霉游動(dòng)孢子囊產(chǎn)生能力的穩(wěn)定性較好。

由圖1可知，供試菌株中有11株游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量為0.27×103～1.47×103個(gè)/ml，11株為2.13×103～3.87×103個(gè)/ml，16 株為 4.07 ×103～6.00 ×103個(gè)/ml，11 株為6.33 ×103～7.87 ×103個(gè)/ml，3 株為 8.20 ×103～8.87 ×103個(gè)/ml，2株為10.33 ×103～11.33 ×103個(gè)/ml，2 株為 12.20×103～13.73 ×103個(gè)/ml?？梢?，產(chǎn)孢量中等(4.07 ×103～7.87×103個(gè)/ml)的菌株有27個(gè)。

表2 安徽省辣椒疫霉的游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量 ×103個(gè)/ml

圖1 辣椒疫霉游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量的頻次分布

2.3 辣椒疫霉對(duì)辣椒的致病力與游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量的相關(guān)性 56個(gè)辣椒疫霉菌株中，有的菌株游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量低、致病力弱，有的菌株產(chǎn)孢量高、致病力強(qiáng)，但也有產(chǎn)孢量低、致病力強(qiáng)的菌株。相關(guān)性分析表明，辣椒疫霉的游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量與辣椒疫霉對(duì)辣椒植株苗的致病力存在一定的相關(guān)性，但相關(guān)性較小，r=0.165，R2=0.027 2，回歸方程為 y=0.797 7x+40.147(式中x為游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量，y為辣椒疫霉對(duì)辣椒致病力引起的病斑長(zhǎng)度)(圖2)。因此，在一定范圍內(nèi)辣椒疫霉對(duì)辣椒植株苗的致病力強(qiáng)弱與游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量成正相關(guān)，但 r=0.165 ＜0.3，認(rèn)為不相關(guān)。

圖2 辣椒疫霉游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量與對(duì)辣椒植株苗致病力的相關(guān)性

3 討論

游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量是辣椒疫霉主要的生物學(xué)特性之一，56個(gè)辣椒疫霉菌株在相同的培養(yǎng)條件下產(chǎn)孢量存在顯著性差異。游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量與菌株的地理來(lái)源無(wú)關(guān)。同時(shí)，辣椒疫霉在培養(yǎng)條件(培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基成分、搖床轉(zhuǎn)速及搖菌時(shí)間)完全一致的情況下游動(dòng)孢子囊的產(chǎn)量較穩(wěn)定，若其中某一因素發(fā)生變化，產(chǎn)孢量可能會(huì)發(fā)生較大改變。關(guān)于病菌的產(chǎn)孢能力與致病力的相關(guān)性，有研究報(bào)道認(rèn)為稻曲病的產(chǎn)孢能力與致病性有一定的相關(guān)性［14－15］，趙純森等則認(rèn)為禾谷鐮刀菌的產(chǎn)孢量與致病力無(wú)顯著相關(guān)性［16］。該研究認(rèn)為辣椒疫霉游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量與致病力不相關(guān)，有些產(chǎn)孢量低的菌株致病力卻較強(qiáng)，如菌株HF3和ST1，它們的產(chǎn)孢量分別為1.13 ×103和1.33 ×103個(gè)/ml，它們對(duì)辣椒苗所致病斑長(zhǎng)度分別達(dá)63.7和60.2 mm。原因可能是游動(dòng)孢子囊成熟后釋放的游動(dòng)孢子數(shù)目存在差異，也可能是菌株游動(dòng)孢子囊成熟的時(shí)間不同;與辣椒疫霉致病力相關(guān)的因素不僅僅是產(chǎn)孢量，可能還有辣椒的品種、菌絲生長(zhǎng)速率和病菌分泌的毒素。

不同辣椒疫霉菌株產(chǎn)孢量的差異顯然與其菌株的遺傳組成有關(guān)，即菌株的基因型決定了該菌株在人工培養(yǎng)基上的表型特征。不同菌株對(duì)寄主辣椒植株致病力的強(qiáng)弱程度也必然受菌株的遺傳物質(zhì)控制。而相同地理來(lái)源的菌株HF4和HF3對(duì)辣椒的病斑長(zhǎng)度相差28.4 mm，菌株BZ8和BZ13在10%V8培養(yǎng)液中的游動(dòng)孢子囊產(chǎn)量相差1.29×104個(gè)/ml，一定程度上表明同一地區(qū)的辣椒疫霉存在基因多樣性或遺傳變異等。

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