土茯苓中總生物堿的提取工藝研究

任玉蘭等

摘要：為考察土茯苓中總生物堿提取的最佳工藝，采用了L9（34）正交試驗(yàn)法，用電位滴定法改進(jìn)指示劑法指示酸堿滴定終點(diǎn)來測定總生物堿含量，分別探索了乙醇索氏提取法和酸水浸泡法的最佳工藝。結(jié)果表明，酸水浸泡法優(yōu)于索氏提取法，其最佳提取工藝條件為用pH 1、料液比為1∶14（g∶mL）、浸泡提取5 h、提取2次。在該工藝條件下進(jìn)行了總生物堿的提取，總生物堿含量測定為0.054 8%，RSD為2.02%，該工藝合理、重現(xiàn)性好，為土茯苓總生物堿的提取提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：土茯苓；總生物堿；提取工藝；電位滴定法

中圖分類號：R284.2；S567.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）12-2994-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.049

Study on Extraction Technology of Alkaloid in Smilax glabra Roxb

REN Yu-lan， LI Xiao-ling， YOU Jia， CHEN Jia-lin，JIANG Rui

（College of Chemistry and Chemical Engineering， Mudanjiang Normal University， Mudanjiang 157012 ，Heilongjiang，China）

Abstract： The optimum extraction conditions of total alkaloids in Smilax glabra Roxb were studied by using L9（34） orthogonal experiment. The content of total alkaloids were determined by potentiometric titration method. The extraction efficiencies of ethanol soxhlet extraction method and acid water soaking method were compared. The results showed that acid water soaking method is superior to soxhlet extraction method. The optimal extraction technology of total alkaloids in Smilax glabra Roxb were pH 1， ratio of material liquid 1：14， extracting twice and each time for 5h. By this method， the content of total alkaloids in Smilax glabra Roxb was 0.054 8%， the relative standard deviation was 2.02%. This technology is reasonable and its repeatability was good，which could provide reference for extraction technology of Smilax glabra Roxb.

Key words： Smilax glabra Roxb； alkaloid； extraction technology； potentiometric titration method

生物堿是一類含氮的有機(jī)化合物，有類似堿的性質(zhì)，是植物藥有效成分中非常重要的一類。大多數(shù)生物堿均有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，氮原子絕大多數(shù)結(jié)合在環(huán)上（即氮雜環(huán)），具有光學(xué)活性，呈現(xiàn)顯著的生理活性，具有抗炎、抗菌、抗病毒、保肝、抗癌等藥理作用[1-5]。中國早在兩三千年前就已使用含生物堿的中草藥進(jìn)行治療，如從烏頭屬（Aconitum L.）16種植物中分離得到的40多種二萜生物堿具有止痛作用；從麻黃（Ephedra sinica Stapf）中提取的麻黃堿有松弛支氣管平滑肌、收縮血管、升高血壓及中樞興奮作用；從鉤藤（Uncaria rhynchophylla（Miq.）Miq. ex Havil.）中提出的鉤藤堿有降血壓、安神和鎮(zhèn)靜作用；從喜樹（Camptotheca acuminata Decne.）中提出的喜樹堿具有抗癌作用，用于治療胃癌、腸癌和白血病等。

土茯苓為百合科植物光葉菝葜（Smilax corbularia Kunth）的干燥根莖，多年生常綠攀緣狀灌木，多生于山坡或林下，分布于中國安徽、浙江、江西、福建、湖南、湖北、廣東、廣西、四川、云南等地。土茯苓含有皂苷、黃酮、生物堿、氨基酸、鞣質(zhì)、多酚等多類成分[6-9]，主要藥用功能為清熱、除濕、解毒等。生物堿的提取方法主要有索氏提取法、浸漬法、滲漉提取法、煎煮法、回流提取法等。劉世旺等[10]測定了土茯苓和菝葜根莖中生物堿的含量，研究中采用的是酸堿指示劑滴定法測定生物堿的含量，但有色溶液會影響終點(diǎn)顏色的判斷。本研究采用電位滴定法來代替酸堿指示劑法指示滴定終點(diǎn)，進(jìn)行定量分析，提高了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性；通過乙醇索氏提取法與酸水冷浸提法的對比研究，探索了提取總生物堿的最佳方案。

1 材料與方法

1.1 材料

土茯苓購于牡丹江市康太大藥房，原產(chǎn)安徽。

1.2 儀器

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHB-3型循環(huán)水多用真空泵，DP-AG型精密數(shù)字氣壓壓力計(jì)，TB-214型分析天平，電熱套，索氏提取器，pHS-2C型酸度計(jì)，磁力攪拌器，酸堿滴定裝置，層析柱等。

1.3 試劑

濃硫酸，濃鹽酸，陽離子交換樹脂，三氯甲烷，無水乙醇，正丁醇，氨水，磷鉬酸，碘，碘化鉀，單寧酸，甲基紅，氫氧化鈉，酚酞，氯化鈉，無水硫酸鈉，鄰苯二甲酸氫鉀，Tris試劑（三羥甲基氨基甲烷），無水乙酸鈉，冰乙酸等，以上均為分析純。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 總生物堿的提取

1）酸水浸泡提取法。取土茯苓樣品10 g，用100 mL稀H2SO4浸泡10 h，過濾取濾液，濾液過陽離子交換樹脂柱，依次用去離子水、乙醇洗滌樹脂柱，再用氨乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氨乙醇，用10 mL乙醇溶解備用。

2）乙醇索氏提取法。取土茯苓樣品10 g，用80 mL無水乙醇索氏提取5 h，提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏，加稀H2SO4溶解，再繼續(xù)蒸發(fā)除去乙醇。抽濾棄去脂溶性雜質(zhì)，濾液用10 mL氯仿平行萃取3次，以進(jìn)一步脫脂，棄去氯仿層。水層用氨水調(diào)pH 8～9，加8 mL氯仿平行萃取5次，合并氯仿層（得脂溶性生物堿）；水層用15 mL正丁醇萃取，再繼續(xù)用10 mL正丁醇平行萃取4次，合并正丁醇層（得水溶性生物堿）。用無水硫酸鈉干燥正丁醇萃出液和氯仿萃出液，減壓蒸餾以除去正丁醇和氯仿，分別用10 mL乙醇溶解備用。

1.4.2 總生物堿的定性檢測 通過鞣酸、磷鉬酸、碘-碘化鉀試驗(yàn)，對所提取的生物堿進(jìn)行了定性分析。

1.4.3 總生物堿的定量測定 取10 mL乙醇于250 mL燒杯中，加50 mL去離子水，精確加入15 mL 0.01 mol/L H2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，3滴甲基紅，將燒杯置于磁力攪拌器上，插入酸度計(jì)，用0.02 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，記錄終點(diǎn)pH和消耗NaOH溶液的體積V1（mL）。將乙醇溶解的樣品溶液轉(zhuǎn)入250 mL燒杯中，加50 mL去離子水，精確加入15 mL 0.01 mol/L H2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，3滴甲基紅，將燒杯置于磁力攪拌器上，插入酸度計(jì)，用0.02 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，pH計(jì)指示終點(diǎn)，記錄終點(diǎn)消耗NaOH溶液的體積V2（mL）。樣品中總生物堿含量折算成東莨菪堿的含量來表示[4]。東莨菪堿的分子式為C17H21NO4，相對分子質(zhì)量為303.348。計(jì)算公式如下：

總生物堿含量=■×100%

1.4.4 索氏提取法正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用乙醇索氏回流提取法提取總生物堿，考察溶劑濃度、提取時(shí)間、料液比（g∶mL，下同）對總生物堿提取的影響，按照單因素優(yōu)化條件設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，因素與水平見表1。

1.4.5 酸水浸泡提取法正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用酸水浸泡提取法提取總生物堿，考察pH、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)對總生物堿提取的影響，因素與水平見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 總生物堿的定性檢測

通過鞣酸、磷鉬酸、碘-碘化鉀試驗(yàn)，對所提取的生物堿進(jìn)行了定性分析，結(jié)果見表3。

2.2 索氏提取法正交試驗(yàn)結(jié)果

索氏提取法正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，各因素對索氏提取法提取土茯苓總生物堿的影響大小順序?yàn)樘崛r(shí)間>料液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取優(yōu)化條件為A3B3C1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時(shí)間為6 h，料液比為1∶6。

2.3 酸水浸泡提取法正交試驗(yàn)結(jié)果

酸水浸泡提取法正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5可知，各因素對酸水浸泡提取法提取土茯苓總生物堿的影響大小順序?yàn)閜H>提取時(shí)間>料液比>提取次數(shù)，提取優(yōu)化條件為A1B2C3D2，即pH 1.0、提取時(shí)間為5 h、料液比為1∶14、提取2次。

2.4 兩種方法的比較

分別在最優(yōu)條件下采用酸水浸泡提取法和乙醇索氏提取法提取總生物堿，測定結(jié)果見表6。由表6可知，樣品的重現(xiàn)性良好，且酸水浸泡法提取生物堿的效率略高于索氏提取法。

3 小結(jié)與討論

采用正交試驗(yàn)分別探索了索氏提取法和酸水浸泡法兩種不同的提取方法的最優(yōu)提取條件，并在優(yōu)化后的條件下分別進(jìn)行了含量測定，結(jié)果表明，酸水浸泡提取法優(yōu)于索氏提取法。土茯苓中總生物堿的最佳提取工藝為pH 1，料液比1∶14，H2SO4浸泡提取5 h，提取2次，在該工藝條件下進(jìn)行了總生物堿的提取，測得總生物堿含量為0.054 8%，RSD為2.02%。定量測定總生物堿含量時(shí)采用酸度計(jì)與磁力攪拌器結(jié)合的電位滴定法取代指示劑法指示酸堿滴定終點(diǎn)，提高了有色溶液終點(diǎn)指示的靈敏度與準(zhǔn)確性。具有一定堿性的生物堿在植物體內(nèi)多以鹽的形式存在，而弱堿性生物堿則以不穩(wěn)定的鹽或游離堿的形式存在，以水為溶劑提取時(shí)前者可被提出，后兩者則提取不完全或不被提取。若用酸水浸泡提取，上述生物堿均可轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的生物堿鹽被提取。故提取生物堿時(shí)采用酸水為溶劑。而一般來說生物堿的含氧酸鹽的水溶解度比較大，故本試驗(yàn)采用硫酸為溶劑來提取生物堿。

游離生物堿及其鹽一般均可溶于甲醇和乙醇，因此普遍采用甲醇或乙醇作為提取溶劑。甲醇有毒且易揮發(fā)，故采用乙醇為溶劑提取生物堿。水溶性生物堿可溶于水和醇，不溶于親脂性有機(jī)溶劑，采用水或酸水浸泡提取法得到的提取液堿化后用有機(jī)溶劑萃取出脂溶性生物堿，在堿水液中還存在水溶性生物堿，利用水溶性生物堿可溶于極性較大而又與水不相混溶的有機(jī)溶劑（如正丁醇、異戊醇或三氯甲烷一甲醇混合溶劑等）的性質(zhì)，用這類溶劑多次萃取含水溶性生物的堿水溶液，回收溶劑即可得到水溶性生物堿。本試驗(yàn)采用的是氨液堿化水層后用正丁醇萃取出水溶性生物堿的方法。

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