重組kisspeptin- 10抑制子癇前期患者HUVECs的體外增殖、遷移及血管形成

李 末，凌 燕，任 敏，況海斌，楊 蓓*

(1.南昌大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室, 江西 南昌 330006； 2.江西省人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 江西 南昌 330006)

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重組kisspeptin- 10抑制子癇前期患者HUVECs的體外增殖、遷移及血管形成

李 末1，凌 燕2，任 敏1，況海斌1，楊 蓓1*

(1.南昌大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室, 江西 南昌 330006； 2.江西省人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 江西 南昌 330006)

子癇前期患者主要特征是胎盤血管形成異常，其血清及胎盤中kisspeptin表達(dá)水平明顯上升[1]，其受體GPR54表達(dá)于冠狀動(dòng)脈，且kisspeptin- 10可促進(jìn)冠狀動(dòng)脈收縮[2]，故推測(cè)，kisspeptin/GPR54系統(tǒng)可能參與子癇前期異常血管的形成與發(fā)展。本研究應(yīng)用體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)，觀察kisspeptin- 10對(duì)子癇前期患者HUVECs增殖、遷移及血管形成的影響，揭示其在子癇前期發(fā)病中作用。

1 材料與方法

1.1 材料：臍帶取自江西省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，且獲該單位倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)及患者知情同意；GPR54 抗體(Novus公司)；重組Kisspeptin- 10(Phoenix公司)，MTS試劑盒(Promega公司)。

1.2 方法：1)常規(guī)分離與培養(yǎng)HUVECs。2)免疫熒光染色：細(xì)胞經(jīng)甲醇和丙酮固定，后加入兔抗人GPR54 抗體，再用抗兔FITC標(biāo)記的二抗，碘化丙啶(PI)染核，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號(hào)。3)細(xì)胞增殖：采用MTS法。實(shí)驗(yàn)分為5組(每組n=4)：①對(duì)照組；②～④組濃度分別為1、100 nmo/L和1 μmol/L重組Kisspeptin- 10；⑤10%胎牛血清組(10%FCS)。

4)劃痕和管狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)分為3組(每組n=4)：①對(duì)照組；②子癇前期患者組； ③1 μmol/L Kisspeptin- 10干預(yù)組。10% FCS培養(yǎng)48 h時(shí)后，采用尼康 TS2100 采集圖片，用ImageJ軟件計(jì)算細(xì)胞遷移距離和管狀結(jié)構(gòu)的面積。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 GPR54 受體在HUVECs的表達(dá)：GPR54 受體蛋白表達(dá)于HUVECs(圖 1)。

2.2 Kisspeptin- 10對(duì)HUVECs增殖的影響：kisspeptin- 10濃度為 100 nmol/L 和1 μmol/L時(shí)，可明顯抑制HUVECs增殖(P<0.05，P<0.01)；10% 胎牛血清明顯增加HUVECs增殖(P<0.01)(圖 2)。

2.3 Kisspeptin- 10明顯降低HUVECs遷移：1 μmol/L kisspeptin- 10組，HUVECs遷移率為75.2%±9.6%，顯著低于對(duì)照組的100.0%±10.1%(P<0.01)，而 10% FCS組為130.5%±18.3%，顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

A.FITC; B.PI; C.Merge

*P<0.05，**P<0.01 compared to control圖2 MTS分析kisspeptin- 10對(duì)HUVECs增殖的影響Fig 2 Effect of kisspeptin- 10 on the proliferation of HUVECs by MTS analysis

2.4 Kisspeptin- 10對(duì)HUVECs管形形成的影響：1 μmol/L kisspeptin- 10組，HUVECs管形的形成相對(duì)面積為78.1±9.1，顯著低于對(duì)照組的100.0±10.2(P<0.01)，而 10% FCS組為120.3±12.8，顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

3 討論

在黑色素瘤中,有一個(gè)新的cDNA片段，命名為Kiss1，它主要表達(dá)于胎盤和大腦。在合成過程中，Kiss1首先形成一個(gè)含145個(gè)氨基酸的前體，經(jīng)過相關(guān)酶的裂解形成含有54、14、13和10個(gè)氨基酸殘基產(chǎn)物，分別稱為kisspeptin-54、kisspeptin-14、kisspeptin-13和kisspeptin-10，統(tǒng)稱為kisspeptins[2]。kisspeptin- 10與受體GPR54親和力最高,作用最強(qiáng)，故本研究選擇kisspeptin- 10來觀察其對(duì)血管形成的影響。為了明確子癇前期患者血清kisspeptins水平升高對(duì)血管形成的影響，筆者首先觀察了其受體GPR54是否表達(dá)于HUVECs。結(jié)果顯示，GPR54受體表達(dá)于HUVECs，提示該系統(tǒng)可能參與了子癇前期疾病的發(fā)生。

在子癇前期患者中，其主要病理特征是胎盤血管形成異常。本結(jié)果顯示，重組kisspeptin- 10可明顯抑制HUVECs增殖、遷移以及血管管形的形成。已有報(bào)道，子癇前期患者血清及胎盤中kisspeptin表達(dá)水平明顯上升[1]，這可能是導(dǎo)致子癇前期患者胎盤血管的形成障礙原因之一。kisspeptin- 10還可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2和9的分泌，導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵入不足。而血管重構(gòu)障礙及滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入不足，正是子癇前期患者的主要特征。子癇前期患者另一個(gè)主要癥狀是血壓明顯升高，kisspeptin及其受體GPR54表達(dá)于冠狀動(dòng)脈的血管平滑肌，且重組kisspeptin- 10可促進(jìn)冠狀動(dòng)脈收縮[2]。青春期間人體血壓增長(zhǎng)的速率明顯高于青春期前、后，而在青春期間血液中kisspeptins表達(dá)水平明顯升高，升高的kisspeptins也可能通過促進(jìn)血管的收縮，導(dǎo)致子癇前期患者血壓的升高。

綜上所述, kisspeptin/GPR54系統(tǒng)可能參與子癇前期患者異常血管和血壓的形成與發(fā)展。

[1] Qiao C, Wang C, Zhao J,etal. Elevated expression of KiSS- 1 in placenta of Chinese women with early-onset preeclampsia [J]. PLoS One, 2012, 7:1- 9.

[2] Mead EJ, Maguire JJ, Kuc RE,etal. Kisspeptins are novel potent vasoconstrictors in humans, with a discrete localization of their receptor, G protein-coupled receptor 54, to atherosclerosis-prone vessels[J]. Endocrinology, 2007,148:140- 147.

2014- 06- 25

2014- 12- 01

國(guó)家自然科學(xué)基金(81270668，30960118)；江西省“贛鄱英才555工程”(1800066)

1001-6325(2015)04-0526-02

R714

A

*通信作者(corresponding author)：yangbei@ncu.edu.cn