NO調(diào)節(jié)在小鼠生發(fā)泡期卵母細(xì)胞體外成熟中的作用

高風(fēng)蘭，相淑芳，鄭月慧，肖秋香，鄭莉萍，吳 磊

(濱州市人民醫(yī)院 1.腎內(nèi)科； 2.產(chǎn)科， 山東 濱州 256600； 3.南昌大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 生殖研究室， 江西 南昌 330006)

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研究論文

NO調(diào)節(jié)在小鼠生發(fā)泡期卵母細(xì)胞體外成熟中的作用

高風(fēng)蘭1，相淑芳2，鄭月慧3*，肖秋香3，鄭莉萍3，吳 磊3

(濱州市人民醫(yī)院 1.腎內(nèi)科； 2.產(chǎn)科， 山東 濱州 256600； 3.南昌大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 生殖研究室， 江西 南昌 330006)

目的觀察不同濃度硝普鈉(SNP)、左旋硝基精氨酸甲基酯(L-NAME)對小鼠生發(fā)泡(GV)期卵母細(xì)胞體外成熟的影響。方法給小鼠腹腔注射PMSG 8IU，取其雙側(cè)卵巢，用卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)法，分為L-NAME組、SNP+dbcAMP+L-NAME組、P+dbcAMP+SNP+L-NAME組，在倒置生物顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂(GVBD)率及第一極體(PB1)排出率。結(jié)果SNP+dbcAMP組的GVBD率與PB1率分別為(52.5±0.4與32.5±0.1)顯著高于dbcAMP組的(28.0±0.2與11.1±0.7)(P<0.05)。P+dbcAMP+SNP+L-NAME組的GVBD率與PB1率分別為(62.8±0.3與20±1.4)顯著低于P+dbcAMP+SNP組的(90.1±1.3與66.6±0.9)，GVBD率與PB1率顯著性降低(P<0.05)。 結(jié)論L-NAME與二丁酰環(huán)腺苷酸(dbcAMP)抑制小鼠卵母細(xì)胞成熟時(shí)，小劑量NO呈現(xiàn)促進(jìn)作用，這種促進(jìn)作用在孕酮(P)存在時(shí)進(jìn)一步加強(qiáng)。

一氧化氮;卵母細(xì)胞;L-NAME;dbcAMP;孕酮

一氧化氮(nitric oxide，NO)作為一種信使分子，生物作用廣泛。在某些腎臟疾病中，NO作為一種強(qiáng)有力的致病因素，可引起急性炎性反應(yīng)。那么同時(shí)，NO對生殖系統(tǒng)有何影響，近年來研究發(fā)現(xiàn)NO也參與卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟、排卵等卵巢生理活動(dòng)。鼠、豬、牛等哺乳動(dòng)物的卵巢中都有NO合成酶的表達(dá)，提示NO參與卵巢的各種功能。目前認(rèn)為NO對卵母細(xì)胞的成熟呈雙向調(diào)節(jié)作用，小劑量NO供體硝普鈉(sodium nitroprusside,SNP)促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，大劑量NO抑制卵母細(xì)胞成熟[1- 2]。本研究通過觀察不同濃度NO與dbcAMP 或/和孕酮 共同作用下卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)率及第一極體(first polar body,PB1)排出率變化，來探究對其體外成熟的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：孕馬血清促性腺激素(PMSG)(天津市華孚高新生物技術(shù)公司)M199、SNP、左旋硝基精氨酸甲基酯(L-NAME)、dbcAMP、孕酮(Sigma公司)。

1.1.2 動(dòng)物：清潔級雌性昆明小鼠，3～4周齡(15～18 g)(南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，合格證號0229537)。

1.2 方法

1.2.1 卵母細(xì)胞的獲取與分組處理：給小鼠腹腔注射PMSG (8 IU/只)誘導(dǎo)超排卵，44～48 h后斷頭處死，取雙側(cè)卵巢，在體視顯微鏡下用4號針頭小心剔除卵巢周圍組織，刺破卵泡，釋放出卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus cell-enclosed oocyte,CEO)?？谖芪⌒螒B(tài)完好的生發(fā)泡(germinal vesicle,GV)期CEO，反復(fù)漂洗3次，移入每孔裝有950 μL培養(yǎng)液，并加入不同處理因素的4孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔35～70個(gè)左右卵母細(xì)胞，分為SNP組、L-NAME組、SNP+dbcAMP+L-NAME組、P+dbcAMP+SNP+L-NAME組，在37℃、5% CO2、95%空氣、100%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。

1.2.2 成熟度測定:在倒置生物顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞的成熟，包括細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的成熟，分別對應(yīng)為GVBD發(fā)生和PB1排出。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，分別計(jì)算GVBD發(fā)生百分率平均值和PB1排出百分率平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠卵母細(xì)胞成熟過程中的形態(tài)學(xué)變化

剛分離出未成熟的卵母細(xì)胞，可見細(xì)胞內(nèi)有一大核，稱為GV，體外培養(yǎng)4 h后卵母細(xì)胞出現(xiàn)了GVBD，體外培養(yǎng)8 h后卵母細(xì)胞，出現(xiàn)了PB1(圖1)。

2.2 SNP、孕酮、dbcAMP、L-NAME對GV期卵母細(xì)胞體外成熟的影響

2.2.1 小劑量SNP對卵母細(xì)胞體外成熟的影響:不同劑量SNP對GVBD率與PB1排出率均無明顯影響(表1)。

2.2.2 L-NAME對卵母細(xì)胞體外成熟的影響： 1×10-2和1×10-3mol/L L-NAME組，卵母細(xì)胞6 h GVBD率和12 h PB1率均較對照組顯著降低(P<0.05)，GVBD率比對照組低27%和28.1%，PB1率低23.8%和20.3%(表2，3)。

A .immature oocyte containing GV； B.oocyte with GVBD；C.oocyte and the extrused PB1

groupCEO(n)GVBD%PB1%control64±4723±08296±12SNP(1×10-4mol/L)62±3747±06323±01SNP(1×10-5mol/L)67±3696±00326±03SNP(1×10-6mol/L)60±5725±08300±08

表2 L-NAME對卵母細(xì)胞成熟過程中GVBD的影響Table 2 The effect L-NAME on oocytes GVBD

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group.

2.2.3 SNP、dbcAMP、L-NAME對卵母細(xì)胞體外成熟的影響: SNP+dbcAMP組卵母細(xì)胞6 h GVBD率與12 h PB1率較dbcAMP組顯著升高(P<0.05)(GVBD率升高24.5%，PB1率升高21.4%)。SNP+dbcAMP+L-NAME組6 h GVBD率與12 h PB1率較SNP+dbcAMP組均有顯著降低(P<0.05)，(GVBD率降低41.1%，PB1率降低19.2%)(表4,5)。

2.2.4 孕酮、dbcAMP、SNP、L-NAME對卵母細(xì)胞體外成熟的影響:P+dbcAMP組卵母細(xì)胞6 h GVBD率與12 h PB1率較dbcAMP組均有顯著性升高(GVBD率升高39.7%，PB1率升高21.6%)(P<0.05)。P+dbcAMP+SNP組與P+dbcAMP組比較，卵母細(xì)胞6 h GVBD率升高21.7%、12 h PB1率升高33.9%(P<0.05)。P+dbcAMP+SNP+L-NAME組與P+dbcAMP+SNP比較，卵母細(xì)胞6 h GVBD率降低27.3%、12 h PB1率降低46.6%(P<0.05)(表6,7)。

表3 L-NAME對卵母細(xì)胞體外成熟過程中PB1的影響Table 3 The effect L-NAME on oocytes PB1

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group.

表4 SNP、dbcAMP、L-NAME對卵母細(xì)胞GVBD的影響Table 4 The effect of SNP,dbcAMP,L-NAME on oocytes GVBD

*P<0.05 compared with dbcAMP group；**P<0.01 compared with control group；#P<0.05 compared with dbcAMP+SNP group.

表5 SNP、dbcAMP、L-NAME對卵母細(xì)胞PB1的影響Table 5 The effect of SNP,dbcAMP,L-NAME on oocytes PB1

*P<0.05 compared with dbcAMP group；**P<0.01 compared with control group；#P<0.05 compared with dbcAMP+SNP group.

表6 P、SNP、dbcAMP、L-NAME對卵母細(xì)胞GVBD的影響Table 6 The effect of P,SNP,dbcAMP,L-NAME on oocytes GVBD

*P<0.05 compared with P+dbcAMP group；**P<0.01 compared with dbcAMP group；#P<0.05 compared with P+dbcAMP+SNP group.

表7 P、SNP、dbcAMP、L-NAME對卵母細(xì)胞PB1率的影響Table 7 The effect of P,SNP,dbcAMP,、L-NAME on oocytes PB1

*P<0.05 compared with P+dbcAMP group；**P<0.01 compared with dbcAMP group；#P<0.05 compared with P+dbcAMP+SNP group.

3 討論

NO是調(diào)節(jié)生殖功能的重要信號因子之一，參與卵母細(xì)胞成熟、受精及胚胎發(fā)育多種生理活動(dòng)[3]。生理狀態(tài)下，卵巢合成的NO對卵母細(xì)胞的成熟起促進(jìn)作用[4- 5]。對于小鼠復(fù)合卵母細(xì)胞體外自發(fā)成熟，NO呈現(xiàn)雙向調(diào)節(jié)作用，小劑量的NO促進(jìn)CEO成熟，大劑量的NO對CEO與裸卵體外成熟都有抑制作用[2，4- 6]。以前的大多數(shù)研究集中于大劑量NO對卵母細(xì)胞體外成熟，而小劑量NO對卵母細(xì)胞體外成熟影響，有學(xué)者進(jìn)行研究[1- 2,7]。對其作用形式進(jìn)行了探討，但迄今對其作用機(jī)制還不明了。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了小劑量NO促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，雖然單獨(dú)給予小劑量SNP，對卵母細(xì)胞的成熟并沒造成影響。但應(yīng)用NOS的抑制劑L-NAME時(shí)，阻斷了卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞合成NO，使卵母細(xì)胞的成熟收到明顯的抑制。復(fù)合卵母細(xì)胞本身產(chǎn)生的NO在卵母細(xì)胞的成熟過程中，發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。

卵泡液中存在孕酮、NO等促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟的因子和cAMP、次黃嘌呤(HX)等抑制卵母細(xì)胞成熟的因子，正是這些因子的共同作用使卵母細(xì)胞正常發(fā)育成熟。模仿卵泡內(nèi)液，向培養(yǎng)液中添加dbcAMP,使卵母細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平升高，則卵母細(xì)胞的成熟受到抑制，小劑量SNP(1×10-4～1×10-6mol/L)可以消除dbcAMP對卵母細(xì)胞成熟的抑制作用，L-NAME減弱SNP對dbcAMP的消除作用，這說明存在抑制因素的條件下，卵母細(xì)胞生成的內(nèi)源性NO發(fā)揮促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟的作用。

孕酮(1×10-6mol/L)能夠消除dbcAMP對卵母細(xì)胞成熟的抑制作用，SNP與孕酮起協(xié)同消除作用。這表明NO除了通過與孕酮相同的cAMP-PKA途徑，還存在其他不同于孕酮的途徑如cGMP途徑等促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟[7- 8]。其分子機(jī)制須待下一步實(shí)驗(yàn)中研究。

綜上所述，NO抑制劑和供體影響卵母細(xì)胞成熟、排卵、胚胎的發(fā)育，一些狼瘡性腎炎、子宮內(nèi)膜異位癥[9]等引起不孕的卵泡內(nèi)液中NO濃度也增高,卵母細(xì)胞成熟度差。如果能揭示NO在卵巢的作用機(jī)制，將對不孕癥的治療和計(jì)劃生育避孕藥提供新的思路。

[1] bu S,Xia G，TaoY,etal. Dual effects of nitric oxide on meiotic maturation of mouse cumulus cell-enclosed oocytesinvitro[J].Mol cell Endocrinol,2003,207：21- 30.

[2] Amale MH,Shahne AZ,Dube F,etalEffects of inhibiting nitric oxide synthase on cumulus expansion and nuclear maturation of sheep oocytes[J].Czech J Anim Sci,2011,56:284- 291.

[3] Goud PT,Goud AP,Najafi T,etalDirect real-time measurement of intra-oocyte nitric oxide concentrationinvitro[J].PLoS One,2014,9:e98720.doi: 10.1371/journal.pone.0098720

[4] Schwarz KR,Pires PR,de Bem TH,etal.Consequences of nitric oxide synthase inhibition during bovine oocyte maturation on meiosis And embryo development[J].Repprod Domest Anim, 2010, 45:75- 80.

[5] Chmelikova E,Jeseta M,Sedmikova M,etal.Nitric oxide synthase isoforms and the effect of their inhibition on meiotic maturation of porcine oocyte[J].Zygote,2010,18:235- 244.

[6] Pandey AN, Chaube SK.Reduction of nitric oxide level leads to spontaneous resumption of meiosis in diplotene-arrested rat oocytes culturedinvitro[J].Exp Biol Med (Maywood), 2014, doi:10.1177/1535370214545024.

[7] Jeseta M1, Marin M, Tichovska H，etal.Nitric oxide-donor SNAP induces Xenopus eggs activation [J],PLoS One,2012,7:e41509.doi: 10.1371/journal.pone.0041509.

[8] Schwarz KR, Pires PR, Mesquita LG,etal. Effect of nitric oxide on the cyclic guanosine monophosphate (cGMP) pathway during meiosis resumption in bovine oocytes[J].Theriogenology, 2014, 81:556- 564.

[9] Goud PT，Goud AP,Joshi N,etal.Dynamics of nitric oxide altered folliculur microenvironment and oocyte qulity in women with endometriosis[J].Fertil Steril, 2014,102：151- 159.

新聞點(diǎn)擊

糖尿病孕婦細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)更高

2013年7月12日《美國新聞與世界報(bào)道·每日健康新聞》(U.S.News & World Report·HealthDay Reporter)報(bào)道，一項(xiàng)新的研究發(fā)現(xiàn)，比起那些沒有糖尿病的孕婦，糖尿病的孕婦更容易患上一種潛在的致命的細(xì)菌感染。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)對某些抗生素有很強(qiáng)的耐藥性，感染金黃色葡萄球菌有時(shí)甚至?xí)?dǎo)致死亡。

加州大學(xué)研究人員發(fā)現(xiàn)，感染這種金黃色葡萄球菌與懷孕前有糖尿病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。最常見的感染源是皮膚(31%)、尿道(6.4%)、其他生殖器或泌尿器官(5.2%)、傷口(3%)和血液(2%)。

這項(xiàng)研究發(fā)表在《美國感染控制》雜志(American Journal of Infection Control)。

動(dòng)物胰島細(xì)胞在人體內(nèi)產(chǎn)生胰島素

2013年7月12日《美國新聞與世界報(bào)道·每日健康新聞》(U.S.News & World Report·HealthDay Reporter)報(bào)道，一項(xiàng)新的研究為1型糖尿病患者帶來希望：將動(dòng)物胰島細(xì)胞移植到人體，代替人體胰島細(xì)胞產(chǎn)生胰島素。

美國伊利諾伊州西北大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員成功地將大鼠胰島細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)，并實(shí)現(xiàn)了胰島素正常分泌，這無疑是動(dòng)物向人類1型糖尿病患者胰島細(xì)胞移植邁出的令人振奮的第一步。

西北大學(xué)范伯格醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)和微生物學(xué)高級研究員斯蒂芬·米勒(Stephen Miller)教授在新聞稿中說，他們的最終目標(biāo)是能夠?qū)⒇i胰島細(xì)胞植入人體，產(chǎn)生胰島素，幫助人類控制血糖。不過，前面還有一段更艱難的路要走，那就是如何對付動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)入人體后的排斥反應(yīng)。

該研究在線刊登于《糖尿病》(journal Diabetes)雜志。

The effect of NO on meiotic maturation of immature mouse oocytesinvitro

GAO Feng-lan1, XIANG Shu-fang2, ZHENG Yue-hui3*, XIAO Qiu-xiang3, ZHENG Li-ping3, WU Lei3

(1.Dept. of Nephrology; 2.Dept. of Obstetrics, Binzhou People Hopital, Binzhou 256600; 3.Dept. of Repruduction, Medical School, Nanchang University, Nanchang 330006, China)

Objective To study the influence of different doses of Sodium nitroprusside and NW-nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME) on maturation of germinal vesicle stage oocyteinvitro. Methods We used exogenous PMSG to induce mouse superovulate and then took hibateral ovaries. This research consisted of L-NAME group,SNP+dbcAMP+L-NAME group,P+dbcAMP+SNP+L-NAME group. oocyte maturation rate(GVBD percentage,PB1rate) was examined by microscopy.Results Compared with dbcAMP (28±0.2,11.1±0.7) group, the SNP+dbcAMP group GVBD percentage and PB1 rate(52.5±0.4and32.5±0.1)significantly increased (P<0.05). Compared with P+dbcAMP + SNP group(90.1±1.3and 66.6±0.9), the P+dbcAMP+SNP+L-NAME group oocyte GVBD percentage and PB1 rate(62.8±0.3 and 20±1.4) significantly decreased(P<0.05).Conclusions When dbcAMP and L-NAME suppress mouse oocyte maturation, low concentration of NO shows promoting effect, progesterone(P) can enforce this promoting effect.

nitric oxide; oocyte; L-NAME; dbcAMP; progesterone

2014- 09- 05

2015- 01- 04

國家自然科學(xué)基金(30260035)

1001-6325(2015)04-0475-05

R-332

A

*通信作者(corresponding author)：：zhengyuehui@163.com