GP78基因多態(tài)性與冠心病相關(guān)

查額爾敦巴特，付真彥，董春嵐，王 蓓，黃 定

(新疆醫(yī)科大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 心臟中心 冠心病科, 新疆 烏魯木齊 830054)

?

研究論文

GP78基因多態(tài)性與冠心病相關(guān)

查額爾敦巴特，付真彥*，董春嵐，王 蓓，黃 定

(新疆醫(yī)科大學(xué) 第一附屬醫(yī)院 心臟中心 冠心病科, 新疆 烏魯木齊 830054)

目的探討GP78基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性。方法TaqMan SNP 基因分型法對1109例(557例冠心病患者+552例對照者) 無血緣關(guān)系的研究對象進(jìn)行基因分型，并應(yīng)用病例對照的研究方法進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果GP78基因rs2617849位點(diǎn)的基因分型和等位基因頻率在冠心病組和對照組之間的分布存在明顯差異(P<0.05)，冠心病組攜帶 TT 基因型(TT vs CC+CT)和T等位基因高于對照組(P<0.05)，在排除吸煙、高血壓、糖尿病和低密度脂蛋白膽固醇等混雜因素后，仍存在顯著性差異 (95% CI：1.035 ～ 1.736，P<0.05)。結(jié)論GP78基因的rs2617849位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病相關(guān)，rs2617849的TT基因型和T等位基因可作為冠心病易感基因標(biāo)記。

GP78;單核苷酸多態(tài)性；病例對照；冠心病

冠心病(coronary heart disease，CHD)，是目前病死率最高的疾病之一, 其形成主要是由于炎性反應(yīng)、血脂代謝紊亂等導(dǎo)致血管內(nèi)皮失去完整性,血管硬化、狹窄,使心肌供血不足。低密度脂蛋白膽固醇長期沉積于血管內(nèi)引起冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，最終導(dǎo)致血液供應(yīng)不足而產(chǎn)生心肌梗死[1]。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)催化HMG-CoA生成甲羥戊酸(Mevalonate)，是膽固醇合成途徑中關(guān)鍵的限速步驟，它在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平受甾醇的負(fù)反饋調(diào)控，其中甾醇促進(jìn)的HMGCR蛋白酶體降解是膽固醇合成途徑關(guān)鍵的反饋調(diào)控步[2]。甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋(sterol regulatory element binding proteins,SREBPs)途徑是膽固醇合成的另一個(gè)重要途徑[3]。通過免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜的實(shí)驗(yàn)方法, 鑒定出介導(dǎo)HMGCR泛素蛋白酶體降解途徑的泛素連接酶是GP78[2]。 GP78響應(yīng)胞內(nèi)不同的代謝信號(hào), 分別介導(dǎo)HMGCR和Insig-1蛋白的快速降解來參與上述兩個(gè)膽固醇合成的重要途徑從而精確地調(diào)控膽固醇的合成速率。其在膽固醇的生物合成調(diào)節(jié)中起著很重要的作用。本研究的目的就是應(yīng)用病例對照的研究方法研究GP78基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料與對象

1.1.1 研究對象：557例冠心病患者。552例對照者。研究對象間無血緣關(guān)系，為2006年1月至2013 年1月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收集。冠心病患者的入選標(biāo)準(zhǔn)為: 采用Judkin法行冠脈造影證實(shí)至少有1支血管的狹窄程度≥50%。對照組入選標(biāo)準(zhǔn): 心電圖排除冠心病或冠脈造影陰性;無心絞痛、冠心病史。對照組人群并非完全健康人群，他們當(dāng)中有些人也有冠心病的危險(xiǎn)因素，如高血壓、糖尿病、高脂血癥，但是沒有心肌梗死病史，改良 Rankin 量表評分均為0分。所有的研究對象都收集了糖尿病、高血壓和吸煙等冠心病傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素相關(guān)的數(shù)據(jù)和信息。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝、腎功能不全者; 腫瘤患者;本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)并獲得了研究對象的知情同意。

1.1.2 試劑:TaqMan Universal PCR master Mix試劑盒(含dNTP PCR緩沖液和AmpliTaq Gold DNA聚合酶)和SNP Genotyping Product試劑盒(含引物和探針)(ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取: 照常規(guī)酚-氯仿抽提法提取上述病例及對照外周血白細(xì)胞的 DNA，稀釋 DNA 樣本并用紫外可見分光光度計(jì)檢測 DNA 濃度，保證各DNA樣本濃度基本一致。

1.2.2 選擇SNP位點(diǎn)：登陸人類Hap-Map計(jì)劃數(shù)據(jù)庫查找標(biāo)簽 SNP(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP),如果設(shè)置條件為r2≥0.5,最小基因頻率(MAF)≤ 0.1我們獲得了GP78基因標(biāo)簽SNP，rs2617849。

1.2.3 TaqMan法檢測SNP SNP位點(diǎn)采用TaqMan SNP分型技術(shù)(AB7900HT實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀) 進(jìn)行基因分型。PCR反應(yīng)體積為5 μL，內(nèi)含2×TaqMan Master Mix 2.5μL、40×探針0.1 μL、dH2O 1.7 μL、模板DNA(40 mg/L)0.7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min預(yù)變性,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min(40循環(huán))。

1.2.4 生化檢查:血漿總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、空腹血糖、三酰甘油、尿素氮等均由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬臨床檢驗(yàn)中心檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

冠心病組的體質(zhì)指數(shù)、空腹血糖和低密度脂蛋白膽固醇均高于對照組(P<0.01); 高血壓、糖尿病的患病率(P<0.01)和吸煙率(P<0.05)也高于對照組(表1)。

rs2617849的基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，rs2617849的基因分型和等位基因頻率在冠心病和對照組的分布存在差異(P<0.05)，冠心病組的TT基因型和T等位基因均高于對照組(P<0.05)(表2)。

多元回歸分析：因?yàn)楦哐獕骸⑻悄虿『臀鼰熓枪谛牟〉? 個(gè)主要危險(xiǎn)因素，在排除這3個(gè)危險(xiǎn)因素之后，冠心病組(rs2617849) 的TT基因型仍然高于對照組(P<0.05)(表3)。

3 討論

高膽固醇是引起冠心病的主要危險(xiǎn)因素之一[4]。SREBP通路與HMGCR降解通路是膽固醇合成過程中兩個(gè)主要的負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制[5]。甾醇誘導(dǎo)的HMGCR降解是通過泛素(ubiquitin)蛋白酶體途徑完成的。介導(dǎo)HMGCR泛素蛋白酶體降解途徑的泛素連接酶是GP78。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平升高時(shí),Insig結(jié)合HMGCR, 同時(shí)還結(jié)合GP78。GP78催化HMGCR在89位與248位賴氨酸殘基的泛素化[2]。泛素化的HMGCR被迅速遞送到蛋白酶體進(jìn)行降解, 從而降低細(xì)胞內(nèi)合成膽固醇的速率。GP78參與了兩個(gè)相反的生物過程。一方面, GP78可以催化HMGCR泛素化使其快速降解。由于HMGCR是膽固醇生物合成過程中的限速酶，其降解后導(dǎo)致膽固醇合成下降[2,6-8]。另一方面, GP78也參與了Insig-1的泛素化-蛋白酶體降解途徑[9]。Insig-1是SREBP成熟剪切過程中的負(fù)調(diào)控因子[10- 12]。如果快速降解Insig- 1, 就可以解除對SREBP通路的抑制, 激活其下游靶基因的表達(dá), 從而上調(diào)脂質(zhì)合成。凈效果是肝臟膽固醇和脂肪酸的生物合成增加[13]。由此可推斷GP78促使膽固醇的合成增加，相應(yīng)的冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)也增加。

表1 研究對象的臨床資料特征Table 1 Characteristics of study participants

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group.

表2 冠心病組和對照組基因型和等位基因分布Table 2 Genotype and allele distribution of CHD and control groupe

*P<0.05 compared with control group.

表3 多元回歸分析Table 3 Logestic regression

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group.

本研究發(fā)現(xiàn)，GP78基因rs2617849的基因型和等位基因頻率在冠心病組和對照組之間的分布存在明顯的差異，這表明攜帶 TT基因型(rs2617849)的人群發(fā)生冠心病的風(fēng)險(xiǎn)增加，雖然 rs2617849位于GP78基因的內(nèi)含子沒有功能,但是它可能和鄰近有功能的SNP緊密連鎖組成不同的單體型,潛在影響GP78 酶的結(jié)構(gòu)和活性,攜帶 TT基因型和T等位基因(rs2617849)的人群可能具有較強(qiáng)的合成膽固醇的能力，而膽固醇是導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的重要因素，故冠心病的發(fā)病增加，rs2617849 的TT 基因型和T等位基因可作為冠心病的易感基因標(biāo)記。

總之，本研究證實(shí)GP78基因的rs2617849位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病相關(guān)，從遺傳流行病學(xué)角度認(rèn)為rs2617849位點(diǎn)的TT基因型和T等位基因作為冠心病易感基因標(biāo)記，但是冠心病是多基因遺傳與多環(huán)境因素共同作用的慢性疾病[14],故冠心病發(fā)病仍存在環(huán)境等因素的干擾，由于本研究樣本量小，結(jié)果可能存在一定的局限性，還需要大樣本量的研究更進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果，并能從基因功能方面進(jìn)一步闡述GP78基因與冠心病的相關(guān)性。

[1] Silbernagel G, Fauler G,etal. The relationships of cholesterol metabolism and plasma plant sterols with the severity of coronary artery disease[J]. J Lipid Res 2009,50:334- 341.

[2] Song BL, Sever N, DeBose-Boyd RA.GP78, a membrane anchored ubiquitin ligase, ass-ociates with Insig-1 and couples sterol-regulated ubiquitination to degradation of HMG CoA reductase[J]. Mol Cell，2005，19: 829- 840.

[3] Sato R. Sterol metabolism and SREBP activation[J]. Arch Biochem Biophys，2010，501: 177- 181.

[4] Ge L, Wang J,Qi W,etal.The Cholesterol Absorption Inhibitor Ezetimibe Acts by Blocking the Sterol-Induced Internalization of NPC1L1[J].Cell Metab，2008，7:508- 519.

[5] DeBose-Boyd RA. Feedback regulation of cholesterol synthesis: Sterol accelerated ubiqui-tination and degradation of HMG CoA reductase[J]. Cell Res，2008，18: 609- 621.

[6] Brown MS, Goldstein JL.A proteolytic pathway that controls the cholesterol content of membranes, cells, and blood[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1999:11041- 11048.

[7] St PP, Nabi IR. The GP78 ubiquitin ligase: Probing endoplasmic reticulum complexity[J]. Protoplasma, 2011, 249: 11- 18.

[8] Chen Z, Du S, Fang S. GP78: A multifaceted ubiquitin ligase that integrates a unique protein degradation pathway from the endoplasmic reticulum[J]. Curr Protein Pept Sci, 2012, 13: 414- 424.

[9] Lee JN, Song B, DeBose-Boyd RA,etal. Sterol-regulated degradation of Insig- 1 medi-ated by the membrane-bound ubiquitin ligase GP78[J]. J Biol Chem, 2006,281: 39308- 39315.

[10] Engelking LJ, Kuriyama H, Hammer RE,etal. Overexpression of Insig- 1 in the livers of transgenic mice inhibits SREBP processing and reduces insulin-stimulated lipogenesis[J]. J Clin Invest, 2004, 113: 1168- 1175

[11] Gong Y, Lee JN, Lee PC,etal.Sterol-regulated ubiquitination and degradation of Insig- 1 creates a convergent mechanism for feedback control of cholesterol synthesis and uptake[J]. Cell Metab,2006, 3: 15- 24.

[12] Tang JJ, Li JG, Qi W,etal.Inhibition of SREBP by a small molecule, betulin, improves hyperlipidemia and insulin resistance and reduces atherosclerotic plaques[J]. Cell Metab, 2011, 13, 44- 56.

[13] Liu TF, Tang JJ, Li PS,etal. Ablation of GP78 in liver improves hyperlipidemia and insulin resistance by inhibiting SREBP to decrease lipid biosynthesis[J]. Cell Metab, 2012,16: 213- 225.

[14] Zee RY, Cheng S, Erlich HA,etal.Genetic variants of arachidonate 5-lipoxygenase-activating protein, and risk of incident myocardial infarction and ischemic stroke: a nested case-control approach[J].Stroke,2006,37:2007- 2020.

GP78 gene polymorphism is associated with coronary heart disease

CHA Erdenbat，F(xiàn)U Zhen-yan*, DONG Chun-lan, WANG Bei, HUANG Ding

(Heart Center，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China)

Objective To evaluate potential association between humanGP78 gene and coronary heart disease(CHD). Methods The genotype was analyzed with by a Real-time PCR instrument in CHD group (n=557) and control group(n=552).The data were evaluated via case control study. Results The distribution of rs2617849 genotype and allele frequency showed significant difference between CHD and control subjects(P<0.05),the distribution of the TT genotype and T allele was significantly higher in CHD patients than control subjects(P<0.05).The significance of the TT genotype between CHD patients and control subjects retained after adjustment for covariates (95% CI: 1.035 ～1.736，P<0.05). Conclusions rs2617849 polymorphism is closely associated with CHD，TT genotype and T allele of rs2617849 functions as a genetic marker of CHD．

GP78; single nucleotide polymorphism; case-control study; coronary heart disease

2014- 08- 14

2014- 12- 02

國家自然科學(xué)基金(81260041)；新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目(2013911111)

1001-6325(2015)04-0450-04

R541.4

A

*通信作者(corresponding author)：fuzhenyan316@126.com