尿路致病性大腸埃希菌FYUA基因敲除株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性

鄧 聰，彭 亮，鄧小燕，潘嘉韻，吳曉蔓

(廣州醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 檢驗科， 廣東 廣州 510260)

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研究論文

尿路致病性大腸埃希菌FYUA基因敲除株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性

鄧 聰，彭 亮，鄧小燕，潘嘉韻，吳曉蔓*

(廣州醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 檢驗科， 廣東 廣州 510260)

目的構(gòu)建尿路致病性大腸埃希菌FYUA基因敲除株，比較野生株和敲除株之間生物學(xué)特性的改變。方法利用λ Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建FYUA基因敲除株△FYUA；測定A600繪制CFT073和△FYUA在LB液體培養(yǎng)基和無菌尿液中的增殖曲線；平板菌落計數(shù)法比較CFT073和△FYUA菌落形成能力；利用96孔板結(jié)晶紫染色法比較CFT073和△FYUA生物膜形成能力。結(jié)果成功構(gòu)建CFT073 FYUA基因敲除株△FYUA；CFT073和△FYUA在LB液體培養(yǎng)基中具有相似的增殖曲線，△FYUA在無菌尿液中的增殖速率明顯低于CFT073(P<0.05)；CFT073和△FYUA菌落形成能力無明顯區(qū)別；△FYUA的生物膜形成能力低于CFT073(P<0.05)。結(jié)論FYUA基因?qū)τ诰暝跓o菌尿液中的生長繁殖以及生物膜形成可能發(fā)揮重要作用。

FYUA基因；基因敲除；尿路感染；大腸埃希菌

尿路感染(urinary tract infection，UTIs)是目前臨床上最普遍的細(xì)菌感染之一，每年都有數(shù)百萬人患尿路感染，并且復(fù)發(fā)率很高[1- 2]。80%～90%的尿路感染由尿路致病性大腸埃希菌(uropathogenicEscherichiacoli, UPEC)所引起。

UPEC目前已知的毒力因子包括莢膜、Afa/Dr黏附素、Ⅰ型菌毛、α-溶血素、脂多糖和含鐵產(chǎn)氣桿菌素[3- 5]等。鐵是除乳酸桿菌和伯氏疏螺旋體外所有微生物的必要元素。但宿主體內(nèi)的鐵含量很低并一般與轉(zhuǎn)鐵蛋白等螯合蛋白相結(jié)合。因此病原微生物需要適應(yīng)宿主體內(nèi)鐵限制的環(huán)境并且進化出一種高效的鐵轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。絕大多數(shù)腸桿菌科細(xì)菌基因組中的強毒力島(high pathogenicity island，HPI)可編碼3價鐵螯合復(fù)合物以及受體。利用這些螯合物對鐵的高親和力，可以將結(jié)合于宿主鐵結(jié)合蛋白的鐵解離并將其通過受體運回細(xì)菌[6- 7]。FYUA是HPI中一個重要基因，其編碼產(chǎn)物FYUA定位于細(xì)菌外膜，是3價鐵螯合物的外膜受體。FYUA目前已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與多種腸桿菌科細(xì)菌的毒力密切相關(guān)，且流行病學(xué)調(diào)查資料顯示其與尿路感染的發(fā)生有關(guān)[8- 10]，但FYUA在UPEC中的致病機制目前尚不明確。

本研究通過構(gòu)建UPEC的FYUA基因敲除株，比較其與野生株的生物學(xué)特性，初步探討FYUA基因在UPEC致病中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸埃希菌CFT073菌株(臨床尿路感染分離的大腸埃希菌，由美國南加州大學(xué)洛杉磯兒童醫(yī)院黃勝和教授惠贈)；質(zhì)粒pKD46，為人工構(gòu)建的編碼Red重組系統(tǒng)GAM、BET和EXO基因的重組質(zhì)粒，此質(zhì)粒為溫度敏感型，在37 ℃及以上溫度時停止復(fù)制。pKD4質(zhì)粒，為PCR提供卡那霉素抗性基因的模板,在該抗性基因表達框的兩側(cè)各帶有一個FRT位點，其間的序列可通過定向重組(pCP20質(zhì)粒表達的酵母來源的FRT重組酶)刪除。pCP20質(zhì)粒，具有氨芐青霉素抗性，可編碼FRT重組酶，用于刪除替換目標(biāo)基因的卡那霉素抗性基因，該質(zhì)粒也是溫度敏感質(zhì)粒，通過提高培養(yǎng)溫度可使其從細(xì)胞中消失。

1.2 試劑

TaqPlus DNA聚合酶，質(zhì)粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒(天根生物有限公司)，L-阿拉伯糖(Sigma公司)。氨芐青霉素、卡那霉素和LB培養(yǎng)基等試劑(上海生工生物技術(shù)公司)(氨芐青霉素和卡那霉素在培養(yǎng)基中的工作濃度分別為50、25 mg/L)。測序由上海生工生物技術(shù)公司完成。

1.3 引物設(shè)計與合成

用于擴增FYUA基因外側(cè)同源臂的引物序列：H1-P1:上游引物5′-ACCATTGTCGGTATTTTTGGCG TTTCGCCGTCTTACAGGGACTCACAACACATATGAA TATCCTCCTTAGTTCCTATTC-3′；H2-P2:下游引物5′-TTAACTAGTGGTGTAAAAGGGATACCTTTTCGGT ATCCCTTTTACAATAAGAGCTGCTTCGAAGTTCCT-3′。下劃線序列：FYUA基因兩側(cè)的同源重組手臂序列；無下劃線序列：卡那霉素抗性基因的特異引物序列。鑒定FYUA基因敲除是否成功的引物序列：H3:5′-GTTGCGTCAACAACTGACCCGTATG-3′；H4:5′-C AGGCTAGTATAGTTTGTGGTAGCTATGAG-3′。以上引物均有上海生工生物技術(shù)公司合成，引物所在位置見圖1。

A.FYUA gene and its upstream and downstream primers location; B.KAN resistance gene in pKD4 plasmid and its upstream and downstream primers location圖1 各引物所在位置示意圖Fig 1 Positions of genome-specific primers

1.4 CFT073FYUA基因缺失株的構(gòu)建

外源性打靶片段的擴增與純化：以pKD4質(zhì)粒為模板，H1-P1和H2-P2作為引物，擴增含卡那霉素的靶基因。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s, 65 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)21次，每個循環(huán)退火溫度減0.5 ℃。95 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)15次。最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證條帶正確后，進行膠回收。

Red重組系統(tǒng)的誘導(dǎo)表達和外源線性打靶片段的電轉(zhuǎn)化：將pKD46質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的CFT073菌株中，在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中30 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1∶100接種至50 mL LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，同時加入100 μL 1 mol/L L-阿拉伯糖，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)至A600達到0.5。冰上預(yù)冷15 min，4 ℃， 4000 r/min離心15 min，棄培養(yǎng)基，用冰冷滅菌去離子水洗滌菌體，重復(fù)3次后，濃縮100倍成感受態(tài)細(xì)胞。 取5 μL純化的打靶片段和50 μL感受態(tài)細(xì)胞至預(yù)冷的電擊杯(0.2 cm)中，用Bio-rad電轉(zhuǎn)儀進行電轉(zhuǎn)化(電轉(zhuǎn)參數(shù)：電阻200 Ω，電容25 μF，電壓2.5 kV, 電擊時間4.6 ms)。電擊后迅速加入1 mL 37 ℃保溫的LB培養(yǎng)基。吹打混勻，轉(zhuǎn)移至新的無菌1.5 mL 離心管，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)復(fù)蘇2 h。取500 μL轉(zhuǎn)化菌液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)至單菌落形成。用外側(cè)引物H3和H4進行PCR方法篩選陽性克隆, 如發(fā)生正確重組，則擴增長度為2 120 bp，未正確重組的克隆PCR長度仍為2 675 bp。陽性克隆命名為CFT073/ΔFYUA/KAN。

卡那霉素抗性基因的刪除：將pCP20質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入CFT073/ΔFYUA/KAN感受態(tài)細(xì)胞，取500 μL轉(zhuǎn)化菌液涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，30 ℃過夜培養(yǎng)至單菌落形成。用外側(cè)引物H3和H4進行PCR反應(yīng)鑒定，如卡那霉素抗性基因被刪除，則擴增長度為727 bp，未發(fā)生正確刪除的克隆PCR長度仍為2 120 bp。篩選出FYUA基因和卡那霉素抗性基因均被刪除的陽性克隆。將該陽性克隆劃線接種LB平板(無抗性)，42 ℃培養(yǎng)過夜(高溫培養(yǎng)促使pCP20質(zhì)粒丟失)。

pCP20質(zhì)粒丟失的鑒定：隨機挑選1個克隆接種入20 μL LB培養(yǎng)液，取10 μL劃線接種LB(含50 mg/L氨芐青霉素)平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日觀察，無克隆生長，即表示pCP20質(zhì)粒已丟失。

FYUA敲除菌株的鑒定：用外側(cè)引物H3和H4進行PCR反應(yīng)鑒定,選取片段長度相符的PCR產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖電泳膠回收后，送上海生工生物技術(shù)公司測序。測序驗證正確敲除的菌株命名為△FYUA。

1.5CFT073與ΔFYUA在LB培養(yǎng)液中增殖曲線的測定

分別從新鮮涂布的平板上挑取CFT073和ΔFYUA單菌落接種至5mLLB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180r/min振蕩培養(yǎng)過夜，次日再將菌液以1∶100的比例接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃,180r/min培養(yǎng)，每隔2h取樣測定A600，繪制增殖曲線。實驗重復(fù)3次。

1.6CFT073與ΔFYUA在無菌尿液中增殖曲線的測定

征集10名志愿者(志愿者過去無尿路感染史且2個月內(nèi)未使用過抗生素)，每次實驗隨機選取3～4名志愿者，留取新鮮尿液，混合后經(jīng)無菌過濾，存放于冰箱2～3d內(nèi)待用。挑取CFT073和△FYUA單菌落，分別接種至5mLLB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180r/min振蕩培養(yǎng)過夜，次日再將菌液以1∶100的比例接種于無菌尿液，37 ℃，180r/min搖床培養(yǎng)，每隔2h取樣測定A600，繪制增殖曲線。實驗重復(fù)3次。

1.7 菌落形成能力的比較

采用平板菌落計數(shù)法。凍存菌液接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，180r/min振蕩培養(yǎng)過夜，取100μL菌液，加入900μLLB培養(yǎng)基中，倍比10倍稀釋，1×10-6和1×10-7稀釋菌液涂布LB平板，靜置培養(yǎng)過夜后計算菌落數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.8 FYUA基因缺失對生物膜形成能力的影響

CFT073和△FYUA菌液接種于LB液體培養(yǎng)基中, 37 ℃，180r/min搖床培養(yǎng)過夜，次日取1mL菌液, 12 000r/min離心2min，用1mL無菌尿液重懸，每孔15μL接種于24孔板，再向每孔中加入1.5mL無菌尿液稀釋混勻。每種菌株接種5個復(fù)孔，同時設(shè)置3孔不加菌的無菌尿液作為空白對照。24孔板置于37 ℃靜止孵育12h。12h后，棄上清，無菌PBS緩沖液輕輕沖洗3次。風(fēng)干后 0.1%結(jié)晶紫染色15min，無菌PBS清洗3次。80∶20的乙醇：丙酮溶液提取結(jié)晶紫。每孔各取200μL提取物至96孔板，酶標(biāo)儀檢測570nm處的吸光度(A)值。每孔重復(fù)測量3次，取平均值。取5個復(fù)孔的平均值減去空白對照孔的A570平均值為其A值。實驗重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1PCR擴增外源打靶線性片段

如圖2所示，擴增出兩端與FYUA基因上下游同源，中間為卡那霉素抗性基因的DNA線性片段，經(jīng)電泳鑒定長度為1 567bp，與理論值一致(圖2)。

1.target linear fragment,1 567 bp; M.DNA Marker,圖2 外源打靶線性片段電泳圖Fig 2 Electrophoresis for exogenous target linear fragment

2.2 卡那抗性基因替代FYUA基因

如圖3所示，2號克隆為發(fā)生正確重組的克隆，命名為CFT073/ΔFYUA/KAN。

M.DNA Marker; 1～7.amplified results of clone No.1～7; 8.negative control圖3 CFT073/ΔFYUA/KAN的PCR鑒定Fig 3 Identification for CFT073/ΔFYUA/KAN by PCR

2.3 卡那霉素抗性基因的刪除

如圖4所示：第5號克隆為陽性克隆，該克隆的FYUA基因被敲除, 卡那霉素抗性基因也被刪除。

M.DNA Marker; 1～8.amplified results of clone No.1～8圖4 卡那霉素抗性基因刪除的PCR鑒定Fig 4 Identification for deletion of KAN resistant gene by PCR

2.4 測序驗證

結(jié)果證實局部序列與預(yù)期系列完全一致，測序驗證正確的菌株命名為ΔFYUA。

圖5 CFT073與ΔFYUA在LB液體培養(yǎng)基中的增殖曲線Fig 5 Proliferation curves of CFT073 strain and △FYUA strain in Luria-Bertani liquid medium

2.5 CFT073與ΔFYUA增殖曲線的測定

在LB液體培養(yǎng)基中，ΔFYUA和CFT073菌株具有相似的增殖曲線 (圖5)。而在無菌尿液中，ΔFYUA的增殖速率明顯低于CFT073菌株(P<0.05),并且無論是ΔFYUA還是CFT073菌株，其在無菌尿液中的增殖總數(shù)都遠(yuǎn)低于LB液體培養(yǎng)基(圖6)；12 h后，無菌尿液中生長的ΔFYUA和CFT073菌株都進入衰亡期，菌株數(shù)目迅速減低。而LB液體培養(yǎng)基中，一直到20 h，菌株還維持較高的增殖速率。

2.7 生物膜形成能力比較

CFT073 570 nm處的吸光度A值為0.43±0.04，顯著高于ΔFYUA的0.33±0.05(P<0.05)。

圖6 CFT073與ΔFYUA在無菌尿液中的增殖曲線Fig 6 Proliferation curves of CFT073 strain and △FYUA strain in sterile urine

2.6 落形成能力比較

ΔFYUA和CFT073菌株在平板培養(yǎng)14 h后菌落形成能力無顯著差異(表1)。

表1 CFT073和ΔFYUA菌落形成能力比較Table 1 Comparison on colony formation abilities between CFT073 strain and △FYUA strain

3 討論

基因敲除是研究某一具體基因功能最直接的方法。本研究使用的基因敲除的方法為λ Red同源重組。該方法只需要較短的同源序列，而不需要特定的限制性酶切位點即可完成重組過程，大大簡化了基因敲除的操作步驟，并且具有很高的重組陽性率。但傳統(tǒng)的λ Red同源重組發(fā)生之后，會在靶標(biāo)分子上留下篩選標(biāo)記基因，以本研究為例，會在目的基因位置留下卡那霉素的篩選標(biāo)記基因。本研究通過引入pCP20質(zhì)粒來實現(xiàn)卡那霉素抗性基因的刪除，同時通過提高培養(yǎng)溫度使pCP20質(zhì)粒從細(xì)胞中消失。通過刪除篩選標(biāo)記基因和去除外源性質(zhì)粒，可以最大程度地減低基因操作對宿主菌的影響，從而更能保證實驗結(jié)果的客觀準(zhǔn)確。

本研究通過構(gòu)建FYUA基因敲除株，研究其在菌株增殖速率、菌落形成能力以及生物膜形成能力的改變。從結(jié)果可見，ΔFYUA和CFT073菌株在LB液體培養(yǎng)基中具有相似的增殖曲線，說明FYUA基因的缺失在營養(yǎng)豐富的LB培養(yǎng)基中對細(xì)菌的增殖速率未產(chǎn)生明顯影響。而在營養(yǎng)物質(zhì)缺乏且鐵含量很低的無菌尿液培養(yǎng)基中，F(xiàn)YUA基因的缺失明顯降低了菌株的增殖速率。在尿液中快速生長繁殖是UPEC致病必需的重要一步，F(xiàn)YUA基因的缺失降低了菌株在尿液中的生長速率，提示FYUA基因可能通過促進細(xì)菌在尿液中的生長繁殖而在UPEC致病中發(fā)揮重要作用，其具體機制還需要進一步深入研究。

細(xì)菌生物膜是指細(xì)菌黏附于生物或非生物的表面時，形成的含有大量細(xì)菌的膜樣復(fù)合物。細(xì)菌感染形成生物膜后，可以發(fā)揮其協(xié)同作用，形成復(fù)雜有序的立體結(jié)構(gòu)，從而可以逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，抵抗吞噬，具有較高程度的耐藥性等，并且可以在生物膜解離后播散導(dǎo)致其他系統(tǒng)的感染。本研究評估了FYUA基因缺失對菌株生物膜形成能力的影響。結(jié)果顯示，F(xiàn)YUA基因敲除株與野生株相比，其生物膜形成能力明顯減低，提示FYUA基因在生物膜形成方面具有一定作用。

尿路感染由于其復(fù)發(fā)率高以及UPEC對多種抗生素的耐藥性，目前仍是臨床治療的重點和難點問題。本研究初步探討了FYUA基因在UPEC致病中的作用，為UPEC致病機制的進一步明確奠定了基礎(chǔ)。

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新聞點擊

肥胖增加偏頭痛概率

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2013-09-09)報道，肥胖者陣發(fā)性偏頭痛的風(fēng)險較高，這是一種常見的偏頭痛，每個月發(fā)作少于14 d；慢性偏頭痛是每個月至少發(fā)作15 d。

美國神經(jīng)學(xué)會指出，偏頭痛是指頭的某部位有節(jié)奏地強烈陣痛，癥狀包括惡心、嘔吐、以及對聲光敏感，有10%以上的人罹患此病。

這篇研究針對超過3 800位高BMI的成人，他們有陣發(fā)性偏頭痛的概率比低BMI的成人81%，尤其是女性及未滿50歲患者。

這種橫斷面的研究無法證明肥胖會造成陣發(fā)性偏頭痛，但醫(yī)生們應(yīng)該建議患者注意飲食與運動。

但到底是先肥胖還是先有偏頭痛？Toledo大學(xué)的Gretchen Tietjen博士認(rèn)為，這有很多種可能性，有可能事先有偏頭痛，開始吃amitriptyline或是valproic acid等藥物，而這些藥物會造成體質(zhì)量增加。

肥胖與偏頭痛有關(guān)的理論：脂肪組織(adipose)中的炎性物質(zhì)釋放，而年輕的婦女以及肥胖者有較多adipose組織，這或許可以解釋為何這些人比較常有偏頭痛。

減重是否代表偏頭痛的頻率會減少呢？專家們認(rèn)為，雖然會鼓勵肥胖者減肥，但這不等于會舒緩偏頭痛。

這篇研究刊登在2013年9月11日的神經(jīng)學(xué)(Neurology)期刊中。

魚翅恐傷神經(jīng)影響生育

據(jù)英國《BBC新聞》(BBC NEWS)2013年9月19日報道，香港政府于2013年9月13日正式公告，今后魚翅不能在香港國宴上出現(xiàn)，而美國紐約也將在2014年7月1日，讓魚翅從餐桌徹底消失。

美國海洋藥物期刊指出，研究員發(fā)現(xiàn)魚翅含有144～1 838 μg/g β-N-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)神經(jīng)毒素，而這與阿爾茨海默病患者、葛雷克氏病患者腦中的神經(jīng)毒素相當(dāng)。

全球頂級的公衛(wèi)雜志EHP在2013年11月5日就刊登了，魚翅含有神經(jīng)毒素BMAA，它與阿爾茨海默病有關(guān)，而且對孕婦和幼童傷害更大。

ConstructionofuropathogenicEscherichia colistrainwithFYUAgenedeletionanditsbiologicalproperties

DENG Cong, PENG Liang, DENG Xiao-yan,PAN Jia-yun, WU Xiao-man*

(Dept. of Clinical Laboratory, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260,China)

Objective To construct aFYUAgene deletion mutant of uropathogenicEscherichiacolistrain CFT073;To compare the different biological properties between wide-type and mutant.Methods λ Red homologous recombination technology was used to construct the FYUA gene deletion strain △FYUA.TheproliferationcurveofCFT073and△FYUAinLuria-Bertaniliquidmediumandsterileurineweredrawedbymeasuringtheabsorbanceat600nm.ColonyformationabilitiesofCFT073and△FYUAwereevalutatdbycountingthenumberofcoloniesintheplates.CrystalvioletstainingmethodwasusedtocomparethebiofilmformationabilitiesofCFT073and△FYUA.ResultsAFYUAgenedeletionstrain△FYUAwassuccessfullyconstructed.CFT073and△FYUA had the similar proliferation curves in Luria-Bertani liquid medium.The proliferation rate of △FYUAinsterileurinewasobviouslyslowerthanCFT073(P<0.05).ThereisnodifferenceincolonyformationbetweenCFT073and△FYUA.Biofilmformationabilityof△FYUAwasweakenedascomparedwithCFT073(P<0.05).ConclusionsFYUAgenemayplaysanimportantroleintheCFT073proliferationandbiofilmformationinsterileurine.

FYUA;geneknockout;urinarytractinfection; Escherichia coli

2014- 09- 15

2014- 12- 01

廣州醫(yī)科大學(xué)青年基金(2013A08)

1001-6325(2015)04-0502-06

R378.2+

A

*通信作者(corresponding author)：wxm622@21cn.com