免疫去除血清高豐度蛋白對(duì)組織蛋白質(zhì)組鑒定的影響

鄒麗莉，李文婷，王丹琪，王 曌，孫 偉*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 中心實(shí)驗(yàn)室， 北京 100005 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 人體解剖與組織胚胎學(xué)系， 北京 100005)

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研究論文

免疫去除血清高豐度蛋白對(duì)組織蛋白質(zhì)組鑒定的影響

鄒麗莉1，李文婷2，王丹琪1，王 曌1，孫 偉1*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 中心實(shí)驗(yàn)室， 北京 100005 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 人體解剖與組織胚胎學(xué)系， 北京 100005)

目的分析去除組織中血清高豐度蛋白對(duì)組織蛋白質(zhì)組鑒定的影響。方法用去除12種血清高豐度蛋白抗體柱處理人甲狀腺和垂體組織樣品，所得到的低豐度蛋白和原樣分別進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析，分別進(jìn)行多肽和蛋白質(zhì)水平的定性定量分析。結(jié)果甲狀腺和垂體組織中血清高豐度蛋白分別被除去了92.11%±12.87%和78%±25%。所鑒定到的多肽和蛋白與原樣品相比，甲狀腺組織的非冗余性多肽提高了70%、蛋白數(shù)目提高了16.5%，垂體的非冗余性多肽提高了21.9%，鑒定蛋白數(shù)目無(wú)明顯變化。結(jié)論去除組織中的血清高豐度蛋白法可以顯著的提高肽段和蛋白的鑒定效率，更適用于血管密集的樣品。

甲狀腺蛋白質(zhì)組; 垂體蛋白質(zhì)組; 去除血清高豐度蛋白; 液質(zhì)聯(lián)用分析

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，組織樣品被越來(lái)越廣泛的用于相關(guān)疾病的生物標(biāo)志物研究[1- 2]。但有些組織樣品周圍或內(nèi)部血管分布比較密集，組織取樣時(shí)容易受到血液污染。而血漿蛋白質(zhì)組中有22種高豐度蛋白約占血漿蛋白的99%，其中濃度最高的可以達(dá)到60～80 mg/mL[3]。即使很少的血液污染都會(huì)引入大量的血漿高豐度蛋白到組織樣品中，在質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)低豐度蛋白會(huì)受到高豐度蛋白的抑制，而很多疾病的生物標(biāo)志物都是組織中的低豐度蛋白[4]，因此去除高豐度蛋白會(huì)有助于低豐度蛋白的檢測(cè)。因此，本研究利用抗原抗體親和的方法除去甲狀腺、垂體組織中的12種血清高豐度蛋白，通過(guò)與未處理樣品比較，定性定量分析所鑒定到的多肽和蛋白質(zhì)，闡述去除血清高豐度蛋白方法對(duì)不同組織蛋白質(zhì)組鑒定效果的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

二硫蘇糖醇(Dithiothreitol, DTT)和碘乙酰胺(Iodoacetamide，IAA)(Sigma公司)；除12中血清高豐度蛋白抗體柱(Thermo 公司)(十二種高豐度蛋白：白蛋白、載脂蛋白A1、載脂蛋白A2、纖維蛋白原、免疫球蛋白A、免疫球蛋白B、免疫球蛋白M、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白、α1酸糖蛋白、α1抗胰蛋白酶和α2微球蛋白)；牛血清白蛋白(BSA)(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)；質(zhì)譜級(jí)胰蛋白酶(Promega公司)； 色譜級(jí)乙腈、甲酸和碳酸氫銨(Merk公司)。

1.2 組織蛋白的提取及蛋白濃度

將取自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院遺體捐獻(xiàn)站的甲狀腺及腦庫(kù)的垂體組織剪碎，用磷酸鹽緩沖液反復(fù)渦旋清洗組織中的血液，直至組織中無(wú)可見(jiàn)血液成分，用裂解液(7 mol/L尿素, 2 mol/L硫脲,0.1 mol/L DTT, 50 mmol/L Tris)溶解組織蛋白，14 000×g離心10 min，保留上清，應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白濃度。

1.3 去除組織樣品中血清高豐度蛋白

每種樣品重復(fù)2次去除血清高豐度蛋白。甲狀腺、垂體樣品直接加到除12種血清高豐度蛋白抗體柱上，將抗體柱放于上下翻轉(zhuǎn)器上。在溫和的翻轉(zhuǎn)條件下，室溫孵育1 h后，1 000×g離心2 min，收集離心下來(lái)的低豐度樣品。兩次除高豐度蛋白得到的甲狀腺、垂體樣品，分別用10 ku套管將溶液置換為裂解液，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白濃度(方法同1.2)，計(jì)算低豐度蛋白的回收率。

1.4 一維膠分離

除高豐度蛋白得到的樣品和原樣加入還原劑和上樣緩沖液，在100 ℃條件下加熱5 min,應(yīng)用4%～12% SDS膠分離，恒壓200 V，時(shí)間35 min。用考馬斯亮藍(lán)染色。Alpha凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.5 蛋白質(zhì)酶切

甲狀腺、垂體低豐度樣品以及原樣分別用膜上酶切方法結(jié)合微波輔助酶切方法進(jìn)行酶切[5- 6]。方法如下：樣品用終濃度為20 mmol/L的DTT在37 ℃時(shí)還原1 h，用終濃度為50 mmol/L的IAA在室溫下避光烷基化45 min。以1∶50的比例加入胰蛋白酶。在水浴的條件下，850 W微波1 min。所得肽段抽干備用。

1.6 質(zhì)譜分析

酶切后肽段溶于1‰甲酸中，多肽用反相毛細(xì)管液相色譜柱(75 μm×100 mm, 3 μm)。洗脫梯度5%～30%流動(dòng)相(0.1%甲酸，99.9%乙腈，pH 2，流速0.3 μL/min)。分離后的多肽用LTQ Orbitrap Velos質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，全掃描范圍為300～2 000 amu(1個(gè)微掃描)，之后為20個(gè)信號(hào)依賴二級(jí)掃描(掃描寬度為3 amu，35%標(biāo)準(zhǔn)化能量碰撞，動(dòng)態(tài)排除1 min)。每個(gè)樣品重復(fù)分析3次。所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)用Mascot(V2.3.02)軟件進(jìn)行分析，所用數(shù)據(jù)庫(kù)為SwissProt人類數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索參數(shù)如下：胰蛋白酶，誤切位點(diǎn)為2，肽段電荷數(shù)2+、3+、4+，肽段質(zhì)量誤差10 ppm，MS/MS質(zhì)量誤差0.1 u,固定化修飾脲甲基化Carbamidomethy(C)。所得數(shù)據(jù)用Scaffold進(jìn)行篩選，在蛋白水平的假陽(yáng)性率小于1%，每個(gè)蛋白至少有2個(gè)特異性肽段。用Progenesis進(jìn)行非標(biāo)記定量分析。

2 結(jié)果

2.1 去除血清高豐度蛋白后的蛋白回收率

甲狀腺、垂體樣品分別用去除12種血清高豐度蛋白抗體柱處理兩次，兩次低豐度樣品回收率沒(méi)有明顯差異。甲狀腺低豐度蛋白的回收率為57.25%±0.35%；垂體低豐度蛋白回收率為40.02%±4.27%。說(shuō)明該方法具有良好的重復(fù)性。

M.marker; T.raw thyroid; P.raw pituitary; T-L1,T-L2.low abundant proteins of thyroid in two repetition; P-L1,P-L2.low abundant proteins of pituitary in two repetition圖1 甲狀腺(T)、垂體(P)樣品除高豐度蛋白前后一維膠結(jié)果Fig 1 One-dimensional gel of thyroid and pituitary before (raw) and after serum high abundant proteins immunodepletion

2.2 去除血清高豐度蛋白樣品和原樣的一維膠結(jié)果

一維膠結(jié)果顯示，甲狀腺、垂體低豐度樣品與原樣相比，大部分條帶沒(méi)有明顯變化，低豐度樣品中的白蛋白(60～80 ku)條帶消失(圖1)。利用非標(biāo)記定量方法所得到的峰面積作為定量標(biāo)準(zhǔn)，比較低豐度樣品和原樣中12種蛋白的相對(duì)量。甲狀腺和垂體去除高豐度蛋白后的樣品中12種血清高豐度蛋白與原樣相比，分別被除去了92.11%±12.87%和78%±25%(表1)，說(shuō)明可以去除大部分組織中的血清高豐度蛋白，對(duì)血運(yùn)豐富的組織效果會(huì)更明顯。

2.3 低豐度樣品和原樣定性分析結(jié)果

甲狀腺低豐度樣品和原樣分別鑒定到多肽數(shù)(1 757±40)、(964±25)個(gè)，蛋白數(shù)(293±4)、(227±6)個(gè)。垂體低豐度樣品和原樣分別鑒定到多肽數(shù)(2 919±173)、(2 513±21)個(gè)， 蛋白數(shù)(655±10)、(674±1)個(gè)。對(duì)比3次質(zhì)譜分析鑒定到的甲狀腺、垂體樣品的非冗余多肽和蛋白數(shù)，甲狀腺低豐度樣品比原樣多鑒定70%多肽和16.5%蛋白(圖2A，C)；垂體低豐度樣品比原樣多鑒定21.9%多肽，鑒定的蛋白數(shù)并無(wú)明顯變化(圖2B, D)。

A, B.peptides of thyroid and pituitary; C,D.proteins of thyroid and pituitary圖2 甲狀腺、垂體樣品鑒定的非冗余肽段、蛋白分析Fig 2 The analysis of non-abundant peptides and proteins from thyroid and pituitary

proteinnamethyroidpituitaryrawlowlow/rawrawlowlow/rawalpha?1?acidglycoprotein117E-0320E-04102%10E-0311E-0384%alpha?1?acidglycoprotein2nonono50E-0500fibrinogenalphachain21E-0320E-04117%40E-0420E-0446%alpha?1?antitrypsin45E-0370E-0515%80E-0400haptoglobin66E-030080E-0400alpha?2?macroglobulinnonono10E-0350E-0438%apolipoproteinA?Ⅰ21E-030020E-0340E-0421%apolipoproteinA?Ⅱnonono50E-0700serotransferrin70E-0430E-04422%20E-0350E-0429%serumalbumin75E-0252E-037%11E-0124E-0223%IgkappachainⅤ?ⅠregionAG10E-040010E-0400IgheavychainⅤ?Ⅲregion70E-050080E-0530E-0538%Igalpha?1chainCregion40E-0430E-0563%30E-0330E-0411%

A.thyroid; B.pituitary; volcano plot showingPvalues (-log10) versus the quantitative ratio between low abundant and raw samples (log2)

圖3 甲狀腺和垂體低豐度與原樣樣品的定量分析

Fig 3 Quantitative analysis of low abundant and raw samples from thyroid and pituitary

2.4 定量分析低豐度蛋白和原樣共同鑒定到的蛋白

非標(biāo)記定量中，甲狀腺和垂體樣品低豐度樣品與原樣分別共同定量了226和454個(gè)蛋白?；鹕綀D分析結(jié)果表明：甲狀腺低豐度樣品鑒定到的蛋白中有68個(gè)高于原樣(占定量蛋白的30.1%)，69個(gè)低于(占定量蛋白的30.5%)原樣中這種蛋白的相對(duì)量(圖3A)，垂體低豐度樣品中89個(gè)高于原樣(占定量蛋白的19.6%),100個(gè)低于(占定量蛋白的22.0%)原樣(差異倍數(shù)：2，P<0.05)(圖3B)。

3 討論

蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，高豐度蛋白會(huì)抑制低豐度蛋白的鑒定，在血漿蛋白質(zhì)組研究中通常去除高豐度蛋白[7]。組織取樣時(shí)，容易受到血液的污染，引入血清中的高豐度蛋白。去除血清高豐度蛋白，有可能會(huì)改善組織低豐度蛋白的鑒定，但目前沒(méi)有相關(guān)研究的報(bào)道。因此本文通過(guò)對(duì)比血運(yùn)密集的甲狀腺和血運(yùn)較少的垂體，去除高豐度蛋白前后多肽和蛋白的結(jié)果，闡述去除血清高豐度蛋白對(duì)組織蛋白質(zhì)組鑒定的影響。

一維膠結(jié)果表明，去除血清高豐度蛋白后，甲狀腺、垂體中白蛋白條帶消失，主要蛋白條帶沒(méi)有變化。通過(guò)非標(biāo)記定量分析，12種血清高豐度蛋白在組織中的含量明顯低于原樣。甲狀腺中高豐度蛋白的去除效果優(yōu)于垂體，說(shuō)明此法可以去除組織中血清高豐度蛋白，且更適合血運(yùn)密集的甲狀腺樣品。但處理后，甲狀腺樣品蛋白的鑒定數(shù)仍然較少，定量分析表明甲狀腺中仍存在高豐度蛋白：甲狀腺球蛋白[8](低豐度樣品中占71.92%，原樣中占58.19%)。處理后它的含量明顯提高，影響其他低豐度蛋白的鑒定，因此，為了得到更好的鑒定結(jié)果，應(yīng)除去甲狀腺中的甲狀腺球蛋白。

定性分析表明，去除高豐度蛋白可以提高甲狀腺肽段和蛋白以及垂體肽段的鑒定數(shù)。并說(shuō)明該法對(duì)血運(yùn)密集的甲狀腺更適用。定量分析及蛋白回收率分析顯示：該方法可以提高部分低豐度蛋白在樣品中的相對(duì)量，有利用質(zhì)譜檢測(cè)，這種提高在血運(yùn)密集的甲狀腺中更明顯，但會(huì)造成部分低豐度蛋白的損失。

通過(guò)質(zhì)譜定性定量分析，除血清高豐度蛋白方法更適合血運(yùn)密集的甲狀腺樣品，能提高鑒定的肽段和蛋白數(shù)。但該方法會(huì)導(dǎo)致樣品損失，處理后的部分低豐度蛋白較原樣顯著降低，可能是由于蛋白的相互作用，使部分低豐度蛋白共同吸附到抗體柱上造成。因此，除血清高豐度蛋白的方法需要優(yōu)化，以減少非特異性吸附的低豐度蛋白損失。同時(shí)，由于個(gè)體差異及不同組織中蛋白特性不同，該方法需更大規(guī)模的驗(yàn)證。

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新聞點(diǎn)擊

惡性腫瘤遇甜會(huì)在儀器照射下發(fā)光

據(jù)英國(guó)《BBC新聞》(BBC NEWS)2013年7月12日?qǐng)?bào)道，巧克力、汽水等含糖食物很快就能用來(lái)偵測(cè)癌癥。近日科學(xué)家研發(fā)一種新技術(shù)，通過(guò)追蹤人體吸收糖分來(lái)發(fā)現(xiàn)癌癥。

科學(xué)家研發(fā)的這種新技術(shù)通過(guò)追蹤人體吸收糖分來(lái)發(fā)現(xiàn)癌癥，原因在于惡性腫瘤快速成長(zhǎng)，會(huì)比健康組織消耗更多葡萄糖。

倫敦大學(xué)學(xué)院(University College London)研究人員調(diào)整磁共振(MRI)掃描儀器，來(lái)查看葡萄糖吸收情況。研究人員發(fā)現(xiàn)，如果人食用甜食，腫瘤在儀器照射下會(huì)發(fā)光。

相較于傳統(tǒng)的放射線技術(shù)，這項(xiàng)新突破提供較安全簡(jiǎn)易的替代方法，沒(méi)有副作用，又能經(jīng)常追蹤癌癥治療反應(yīng)，以及為醫(yī)生選擇治療方式。

研究發(fā)表于《自然醫(yī)學(xué)》(Nature Medicine)雜志。

吸煙與非吸煙女性肺癌患者之差異

據(jù)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(PNAS)網(wǎng)站(2013-07-01)報(bào)道，2011年曾有研究指出，在東亞地區(qū)，大多數(shù)被診斷出有肺癌的女性并沒(méi)有吸煙習(xí)慣，有3個(gè)基因區(qū)的特征可以說(shuō)明除了環(huán)境因素之外，為何亞洲從未吸煙的女性易患肺癌。最近這項(xiàng)法國(guó)研究則發(fā)現(xiàn)，在非吸煙女性身上出現(xiàn)某些基因變異和雌激素受體過(guò)表達(dá)與吸煙女性乳腺癌患者不同。

這項(xiàng)研究比較63位吸煙與77位非吸煙的女性肺癌患者在臨床、病理、生物學(xué)的不同特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不曾吸煙的女性比吸煙的女性有較高比例出現(xiàn)EGFR基因變異(50.8%：10.4%)、以及較低比例的K-Ras基因變異(33.8%：9.5%)，此外，不吸煙女性有較高比例的雌激素受體α表達(dá)。

這項(xiàng)研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)未來(lái)對(duì)于不吸煙的女性肺癌患者，可發(fā)展針對(duì)激素、基因異?；蛲瑫r(shí)針對(duì)兩者的可能治療方法進(jìn)行研究。

該研究刊登于胸腔腫瘤學(xué)期刊(Journal of Thoracic Oncology)

Impact of immunodepletion of serum high abundant protein on tissue proteome identification

ZOU Li-li1, LI Wen-ting2, WANG Dan-qi1, WANG Zhao1, SUN Wei1*

(1.Core Facility of Instrument, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS & PUMC, Beijing 100005; 2.Dept. of Human Anatomy and Embryology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS & PUMC, Beijing 100005, China)

Objective To analyze the impact of immunodepletion of serum high abundant protein on identification of tissue proteome. Methods Human thyroid and pituitary samples were disposed using 12 high abundant protein depletion antibody column. The low abundant proteins and raw samples were analyzed by LC/MS. Identified peptides and proteins were qualitatively and quantitatively analyzed. Results The serum high abundant proteins in thyroid and pituitary were depleted by 92.11%±12.87%, 78%±25% respectively. Compared with raw thyroid, the non-redundant peptide and protein identification of low abundant thyroid were respectively increased by 70%, 16.5%. The non-redundant peptide identification of low abundant pituitary was 21.9% higher than that of raw samples. But the protein identification was profile unchanged. Conclusions The immunodepletion of serum high abundant proteins can significantly improve peptide and protein identification and is more suitable for the tissues with intensive blood vessel.

thyroid proteome; pituitary proteome; serum high abundant protein immunodepletion; LC/MS analysis

2014- 12- 26

2015- 01- 13

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2013CB530805, 2014CBA02005)；中國(guó)科技部重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(2013FY114100)

1001-6325(2015)04-0439-05

R34

A

*通信作者(corresponding author)：sunwei1018@sina.com