G6PD 缺乏癥單細(xì)胞SNaPshot基因診斷方法的建立

吳彤華，成金泉，朱元昌，黃菊，馬珍珍，尹彪，曾勇＊，蔡應(yīng)木

（1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，汕頭 515041；2.深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，深圳 518045；3.深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045；4.深圳市圍著床期生殖免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518045；5.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，汕頭 515041）

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥是人類(lèi)最常見(jiàn)的酶缺陷病之一，全球約4億人受累［1］，我國(guó)南方是高發(fā)區(qū)之一。該病為X 連鎖不完全顯性遺傳，臨床表現(xiàn)具有高度異質(zhì)性，發(fā)病的主要表現(xiàn)為溶血性貧血和由此而產(chǎn)生的以未結(jié)合膽紅素升高為特點(diǎn)的高膽紅素血癥，成年患者最嚴(yán)重的威脅是出現(xiàn)急性腎衰竭，而新生兒期發(fā)病則可導(dǎo)致核黃疸，造成永久性神經(jīng)系統(tǒng)損傷甚至死亡，是聯(lián)合國(guó)衛(wèi)生組織6種主要應(yīng)該預(yù)防和控制的遺傳病之一，亦是廣東省及深圳市出生缺陷干預(yù)工程的干預(yù)病種之一。

植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）是在胚胎植入子宮前進(jìn)行的最早期的產(chǎn)前診斷。性連鎖遺傳性疾病既往一般通過(guò)PGD 性別選擇來(lái)避免有表型的患者出生，但只有針對(duì)致病基因進(jìn)行檢測(cè)才能最為有效地阻斷垂直傳播，實(shí)現(xiàn)優(yōu)生目的。隨著越來(lái)越多的特異性診斷技術(shù)用于PGD，近年性連鎖遺傳性疾病進(jìn)行特異性植入前遺傳學(xué)診斷的比例逐漸增加［2］，但目前仍較少有針對(duì)G6PD 基因進(jìn)行PGD 的報(bào)道，故建立準(zhǔn)確的單細(xì)胞G6PD 基因診斷技術(shù)意義深遠(yuǎn)。多重SNaPshot技術(shù)是近年分子遺傳學(xué)領(lǐng)域用于分析已知單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點(diǎn)的先進(jìn)技術(shù)，其結(jié)合了PCR 技術(shù)和熒光光譜技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，具有快速、高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高通量等特點(diǎn)［3］，使其應(yīng)用到PGD 成為可能。本研究擬采用巢式PCR 對(duì)深圳不孕癥人群G6PD 基因突變高發(fā)的外顯子2、9、11、12［4］進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)多重SNaPshot技術(shù)對(duì)12個(gè)突變位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行基因分型，探討臨床開(kāi)展G6PD 缺乏癥PGD 工作的可行性。

材料與方法

一、細(xì)胞來(lái)源

根據(jù)深圳地區(qū)不孕人群G6PD 基因突變頻率的高低次序［4］，選取最常見(jiàn)的3 種突變類(lèi)型的G6PD缺乏癥女性患者和正常女性各1 例（共4 例），抽取其外周靜脈血，并經(jīng)測(cè)序方法再次確認(rèn)其G6PD 基因型。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.單細(xì)胞模板制備：抽取外周靜脈血2 ml，EDTA-K2抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液（上海恒信化學(xué)試劑）通過(guò)密度梯度離心法分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），經(jīng)洗滌液（含10g／L 人血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液）洗滌后制成PBMC 懸液，在倒置顯微鏡下吸取單個(gè)淋巴細(xì)胞，依次移入3 個(gè)洗滌液微滴中吸洗。將洗滌3次后的單個(gè)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)入含5μl堿性裂解液［200mmol／L KOH，50mmol／L DTT（Sigma-Aldrich，美國(guó)）］的0.2ml滅菌薄壁PCR 反應(yīng)管中，同時(shí)取最后一次洗滌該單個(gè)細(xì)胞的洗滌液移入另一含5μl堿性裂解液的PCR 反應(yīng)管中作為陰性對(duì)照。65 ℃加熱10min裂解細(xì)胞后加入5μl中和液［200 mmol／L tricine（Sigma-Aldrich，美國(guó)）］。

2.引物設(shè)計(jì)合成：巢式PCR 引物和多重SNaPshot延伸引物設(shè)計(jì)采用Primer3 在線(xiàn)引物設(shè)計(jì)軟件完成，由上海生物工程公司合成，序列見(jiàn)表1。

3.巢式PCR：（1）單管多重外側(cè)擴(kuò)增反應(yīng)總體積為50μl，內(nèi)含1×Hot Start Taq PCR 緩沖液，1.5 mmol／L Mg2＋，0.2 mmol／L dNTP，Exon 2 OUT F／R 和Exon 9-13OUT F／R 各0.2μmol／L，1U Maxima Hot Start Taq酶（Fermentas，德國(guó)）和10μl裂解模板液。熱循環(huán)參數(shù)：96 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃30s，56 ℃30s，72 ℃90s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7min。（2）內(nèi)側(cè)擴(kuò)增反應(yīng)分Exon 2IN、Exon 9IN 和Exon 11-12IN 三管獨(dú)立擴(kuò)增，每管總體積為50μl，內(nèi)含1×Hot Start Taq PCR 緩沖液，1.5 mmol／L Mg2＋，0.2 mmol／L dNTP，相 應(yīng) 的Exon IN F／R 0.2μmol／L，1U Maxima Hot Start Taq酶（Fermentas，德國(guó)）和3μl外側(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。熱循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5min；94 ℃30s，（Exon 2 IN 為52 ℃，Exon 9IN 為60 ℃，Exon 11-12IN 為56 ℃）30s，72℃60s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。（3）內(nèi)側(cè)擴(kuò)增PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并記錄。（4）使用QIAquick PCR Purification Kit（Qiagen，德國(guó)）按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行內(nèi)側(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物純化。

4.單管12重SNaPshot基因分型：（1）延伸反應(yīng)總體系為10μl，包括純化后產(chǎn)物3μl、無(wú)核酸酶的去 離 子 水3.25 μl、5×Seq 緩 沖 液1.5 μl、SNaPshot?Multiplex Mix（Applied Biosystems，美國(guó)）1.25μl、5μmol／L SNaPshot引物混合物（95、871、1004、1024、1311、1360、1376、1381、1387、1388、1414和IVS-1193）1μl。熱循環(huán)參數(shù)：96 ℃10s，50 ℃5s，60 ℃30s，25 個(gè)循環(huán)。（2）10μl延伸產(chǎn)物中加入1USAP（Takara，日本）經(jīng)37 ℃60min，75 ℃15 min 進(jìn)行純化。（3）每反應(yīng)體系中加入Hi-DiTMFormamide（Applied Biosystems，美 國(guó)）9μl、GeneScanTM-120LizTMSize Standard（Applied Biosystems，美國(guó)）0.5μl和已純化延伸產(chǎn)物1μl，95 ℃變性5 min，立即置于冰上5 min 后于AB 3500遺傳分析儀（Applied Biosystems，美國(guó)）進(jìn)行毛細(xì)管電泳。應(yīng)用GeneMapper V4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)SNaPshot產(chǎn)物中各峰的位置確定該延伸產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)，根據(jù)峰的顏色可知摻入的堿基種類(lèi)（綠色為A、藍(lán)色為G、黑色為C、紅色為T(mén)）。只在某個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的峰位置出現(xiàn)野生型顏色的峰則表明該位點(diǎn)為野生型；只出現(xiàn)突變型顏色的峰則表明基因型為純合突變型或半合子；同時(shí)出現(xiàn)野生型和突變型顏色的峰則表明該基因型為雜合突變。兩個(gè)或以上位點(diǎn)出現(xiàn)突變型顏色的峰表明存在復(fù)合突變。

結(jié) 果

共獲得166 個(gè)單淋巴細(xì)胞（58 個(gè)為正?；蛐?，108個(gè)為G6PD 基因突變雜合子），其中151個(gè)細(xì)胞（52個(gè)正常，99個(gè)雜合子）擴(kuò)增成功，擴(kuò)增效率為90.97%（151／166）。

成功擴(kuò)增的99個(gè)雜合子單淋巴細(xì)胞中有8個(gè)細(xì)胞在基因分型時(shí)在相應(yīng)突變位點(diǎn)處僅見(jiàn)單峰而未觀察到雜合雙峰，表明PCR 過(guò)程中發(fā)生等位基因脫扣（allele drop out，ADO）現(xiàn)象，ADO發(fā)生率為8.08%（8／99）。

各類(lèi)淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

166例陰性對(duì)照均未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增。內(nèi)側(cè)擴(kuò)增反應(yīng)PCR 產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。正常單細(xì)胞檢測(cè)G6PD 基因12 個(gè)突變位點(diǎn)的峰位置和野生型的峰顏色詳見(jiàn)圖2。各突變雜合子及其野生型等位基因發(fā)生脫扣的SNaPshot圖譜見(jiàn)圖3；各突變雜合子突變型等位基因發(fā)生脫扣的SNaPshot圖譜和正常樣本相同。

圖1 內(nèi)側(cè)擴(kuò)增反應(yīng)PCR 產(chǎn)物2%瓊脂糖電泳圖

表2 單個(gè)淋巴細(xì)胞分析結(jié)果

圖2 正常單淋巴細(xì)胞G6PD 基因12 個(gè)突變位點(diǎn)SNaPshot分型圖譜

圖3 雜合子及其野生型等位基因發(fā)生脫扣的SNaPshot分型圖譜

討 論

G6PD 缺乏癥屬于遺傳性疾病，目前尚無(wú)有效的根治方法，重在預(yù)防。通過(guò)對(duì)G6PD 缺乏癥患者進(jìn)行遺傳咨詢(xún)、產(chǎn)前診斷，對(duì)子代進(jìn)行有效預(yù)防與及時(shí)處理，可減輕本病對(duì)新生兒的危害，降低新生兒出生缺陷率，達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育、提高出生人口質(zhì)量的目的。PGD 是輔助生殖技術(shù)與遺傳學(xué)診斷技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，將對(duì)遺傳疾病診斷的時(shí)機(jī)提前到胚胎發(fā)育的最早階段，選擇正常胚胎植入母體子宮，從而阻斷單基因疾病及染色體異常的患兒出生，這樣既可避免遺傳病的垂直傳播，又可以避免流產(chǎn)和治療性引產(chǎn)給夫婦雙方帶來(lái)的身體和精神上的創(chuàng)傷，已成為一個(gè)更易為人們所接受的產(chǎn)前診斷技術(shù)［5］。

G6PD 缺乏癥作為一種全球高發(fā)病率的單基因遺傳病，既往一般通過(guò)性別選擇以避免有表型的患兒出生，但存在以下問(wèn)題：（1）若父方正常、母方為致病基因的雜合子，生育后代時(shí)無(wú)論男女都有可能攜帶致病基因，以往通過(guò)PGD 選擇女性胚胎移植的做法存在重大缺陷：①淘汰的男性胚胎中有50%可能為正常基因，造成了正常胚胎的浪費(fèi)；②女性胚胎中有50%為雜合子，致病基因還可能遺傳給下一代，并未能從根本上切斷致病基因的遺傳；③國(guó)內(nèi)外報(bào)道均早已證實(shí)女性雜合子個(gè)體可發(fā)?。?-7］，且雜合子是新生兒高膽紅素血癥發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一［8］。（2）若父母雙方均攜帶G6PD基因突變，其后代無(wú)論性別均有50%為G6PD 缺乏癥患者，行性別選擇不能避免該類(lèi)患者的出生。對(duì)于這些情況，須通過(guò)G6PD 基因診斷才能確診胚胎是否正常。

G6PD 缺乏癥的分子基礎(chǔ)為基因突變，全球已報(bào)道突變類(lèi)型超過(guò)180 多種，其中8.0%為復(fù)合突變［9］，中國(guó)人群已發(fā)現(xiàn)28種突變［10］。β地中海貧血的分子基礎(chǔ)亦是多種類(lèi)型的基因突變，目前其PGD方法主要是反向斑點(diǎn)雜交［11］，該方法可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)突變位點(diǎn)，但存在如操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，探針設(shè)計(jì)難度大，膜條制備及雜交過(guò)程中易產(chǎn)生非特異雜交信號(hào)而影響結(jié)果判讀等缺點(diǎn)。SNaPshot技術(shù)即單核苷酸延伸法，又稱(chēng)微測(cè)序法，是以Sanger雙脫氧鏈終止法原理為基礎(chǔ)，以擴(kuò)增出含SNPs位點(diǎn)的PCR 產(chǎn)物為模板，在緊鄰S(chǎng)NPs位點(diǎn)的上游或下游設(shè)計(jì)引物，四種雙脫氧核苷酸分別標(biāo)記不同顏色的熒光染料，在DNA 聚合酶作用下，引物延伸一個(gè)堿基即終止，經(jīng)毛細(xì)管電泳后進(jìn)行片段分析，相當(dāng)于單個(gè)位點(diǎn)的微測(cè)序，檢測(cè)單核苷酸的突變：延伸位點(diǎn)堿基的類(lèi)型決定電泳峰的顏色，延伸引物的片段長(zhǎng)度決定峰的位置。通過(guò)設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的引物可實(shí)現(xiàn)多個(gè)已知SNP位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)，且不管SNP位點(diǎn)是G／C、A／T、G／A、C／T，還是插入／缺失多態(tài)，都可以放在一個(gè)體系中檢測(cè)。另外，熒光檢測(cè)最突出的優(yōu)點(diǎn)是敏感性極高，等位基因檢測(cè)的信號(hào)只有另一個(gè)等位基因的1%甚至更少時(shí)，都能檢測(cè)出來(lái)，從而減少ADO 現(xiàn)象引起的誤診。微測(cè)序技術(shù)因其高靈敏度、可自動(dòng)化、結(jié)果容易判讀等優(yōu)勢(shì)，已逐步被應(yīng)用到多種遺傳病的PGD 中［12］。

我們已成功運(yùn)用多重SNaPshot 技術(shù)建立G6PD 缺乏癥基因診斷方法［13］，在此基礎(chǔ)上結(jié)合巢式PCR 擴(kuò)增G6PD 基因突變高發(fā)的外顯子，成功實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平上對(duì)G6PD 基因12個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè)，擴(kuò)增效率為90.97%，符合歐洲人類(lèi)生殖與胚胎醫(yī)學(xué)會(huì)（ESHRE）對(duì)PGD 的擴(kuò)增效率不低于90%的 要求［14］。該SNaPshot法G6PD 缺 乏 癥PGD 體系從裂解細(xì)胞到獲得最終診斷結(jié)果全程僅需7h，滿(mǎn)足無(wú)論卵裂期還是囊胚期胚胎活檢都能進(jìn)行新鮮胚胎移植的時(shí)效性要求，無(wú)需像運(yùn)用全基因組擴(kuò)增或反向點(diǎn)雜交等方法進(jìn)行囊胚期PGD 時(shí)因有過(guò)夜的實(shí)驗(yàn)流程而凍融胚胎，有效避免對(duì)活檢后胚胎進(jìn)一步的不必要損傷。為了解該多重SNaPshot PGD體系的可靠性，本研究根據(jù)深圳地區(qū)不孕人群G6PD 基因突變頻率的高低次序［4］，選取了最常見(jiàn)的3種突變類(lèi)型的雜合子進(jìn)行單淋巴細(xì)胞G6PD 基因突變檢測(cè)，證實(shí)該體系可以檢出這幾種突變類(lèi)型，ADO發(fā)生率為8.08%，滿(mǎn)足ESHRE 關(guān)于PGD 的ADO 率 低 于10%的 要 求［14］。另 外，該 方 法 檢 測(cè)G6PD 基因突變高發(fā)的Exon 2、Exon 9、Exon 11和Exon 12四個(gè)外顯子上共12 個(gè)突變位點(diǎn)，但實(shí)際G6PD缺乏癥PGD工作中無(wú)需全部檢測(cè)，可根據(jù)夫婦雙方已確診的G6PD基因型，僅針對(duì)發(fā)生突變的位點(diǎn)擴(kuò)增其所在的外顯子并進(jìn)行微測(cè)序，節(jié)約試劑成本。

本研究建立的單細(xì)胞G6PD 基因診斷方法除具有上述優(yōu)勢(shì)外，還因應(yīng)用SNaPshot技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）結(jié)果清晰直觀，易于判讀及分析，峰的位置對(duì)應(yīng)突變的位點(diǎn)，峰的顏色對(duì)應(yīng)堿基種類(lèi)；（2）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行各位點(diǎn)的微測(cè)序，準(zhǔn)確性及特異性與金標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序法相當(dāng)；（3）等位基因選擇性擴(kuò)增是單細(xì)胞PCR 特有現(xiàn)象之一，SNaPshot方法檢測(cè)的是熒光信號(hào)，靈敏度高，可有效減少弱擴(kuò)增的等位基因漏檢，降低ADO 發(fā)生率；（4）成本低廉，約為50元／標(biāo)本，且可通過(guò)選擇購(gòu)買(mǎi)大包裝試劑或使用更小的反應(yīng)體系令成本進(jìn)一步下降；（5）操作簡(jiǎn)單、快捷、自動(dòng)化程度高；（6）鑒于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如果PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化不夠可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果［13］，對(duì)于內(nèi)側(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物本研究改用柱純化取代傳統(tǒng)SNaPshot技術(shù)選用的SAP 及Exon I酶純化，有效避免酶質(zhì)量批間差異對(duì)純化效果的影響并縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，更好地保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和時(shí)效性。

本方法亦存在不足之處：（1）G6PD 基因突變遍及除Exon 1 外所有的外顯子［1］，但本研究建立的PGD 方法僅針對(duì)突變高發(fā)的Exon 2、Exon 9、Exon 11和Exon 12四個(gè)外顯子，在中國(guó)和深圳人群中分別約有7%［15］和2%［4］的G6PD 缺 乏癥患者其基 因突變是在其余外顯子上，該小部分患者暫不能通過(guò)該方法進(jìn)行PGD，這也是本課題組后續(xù)研究的內(nèi)容。（2）結(jié)果檢測(cè)需要特殊設(shè)備，遺傳分析儀較為昂貴。但α 地中海貧血PGD 亦使用相同的儀器平臺(tái)［16］，故在具PGD 資質(zhì)的生殖中心該儀器的普及率相對(duì)較高，不會(huì)對(duì)該方法的應(yīng)用推廣造成太大的影響。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)多重巢式PCR 和SNaPshot微測(cè)序技術(shù)，在單細(xì)胞水平上同時(shí)擴(kuò)增4個(gè)G6PD 基因突變高發(fā)外顯子，一次實(shí)驗(yàn)即可快速、準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)12個(gè)突變位點(diǎn)檢測(cè)，該法有望被具有PGD 資質(zhì)的生殖中心采用，取代傳統(tǒng)的性別選擇，實(shí)現(xiàn)對(duì)G6PD缺乏癥患者真正意義上的植入前遺傳學(xué)診斷。

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