D3非優(yōu)質胚胎的冷凍價值及其臨床結局分析

丁錦麗，楊菁＊，張艷，張怡，徐望明，龍文

（1.武漢大學人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，武漢 430060；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院計劃生育研究所，武漢 430030）

許多因素影響到體外受精-胚胎移植（IVF-ET）的結局，如婦女年齡、子宮內(nèi)膜容受性及內(nèi)膜與胚胎發(fā)育的同步性、移植胚胎的數(shù)量等［1-3］，而胚胎質量是一個重要因素［4］。有研究報道約70%的患者在IVF-ET 過程中獲得非優(yōu)質胚胎［5］，由于非優(yōu)質胚胎的發(fā)育潛能較低，再利用的可能性不大，所以有的生殖中心選擇將其丟棄。關于非優(yōu)質胚胎的臨床利用價值尚存在較大爭議，有研究證實非優(yōu)質胚胎經(jīng)體外培養(yǎng)后可能發(fā)育成囊胚［6］。本研究分析了在我中心行非優(yōu)質胚胎移植的135 個凍融胚胎移植（FET）周期，分析其臨床結局及可能的影響因素，探討非優(yōu)質胚胎的冷凍／移植價值，為臨床工作提供參考。

資料與方法

一、研究對象

收集2010年1月至2012年12月在武漢大學人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心144例行非優(yōu)質胚胎FET夫婦的資料，并納入2011年1月至2011年10月行優(yōu)質胚胎FET 的202對夫婦作為對照。排除子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥和其他可能影響胚胎著床的因素，如男方和／或女方染色體異常；排除供胚移植的患者?；颊吣挲g21～43歲，不孕年限1～17年。

二、治療方法回顧

1.促排卵及受精：采用我中心常規(guī)使用的短方案、長方案、超長方案促排［7］。超聲檢查發(fā)現(xiàn)有3個以上直徑≥18mm 的卵泡時，予以5 000～10 000U劑量的HCG（雪蘭諾，瑞士），36h后在陰道超聲引導下采卵。根據(jù)男方精子質量決定自然受精或卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）受精。

2.胚胎凍融及培養(yǎng)：采用本中心常規(guī)方案［8］，選擇正常受精第3天的胚胎冷凍保存。玻璃化法冷凍按試劑盒（Kitazato，日本）操作程序進行。胚胎解凍后繼續(xù)培養(yǎng)18～24h，再行移植。按解凍試劑盒（Kitazato，日本）說明書解凍胚胎，再轉入Quinn’s培養(yǎng)液（SAGE，美國）培養(yǎng)。

3.胚胎質量評估：D3、解凍后、移植時各評估1次。根胚胎形態(tài)學對胚胎進行分級：解凍前評估時包含6個以上均勻一致的卵裂球且細胞碎片小于20%的胚胎定義為優(yōu)質胚胎［8］，其余為非優(yōu)質胚胎，包括大小不一的卵裂球5個（4或4以下）且胚胎碎片＞20%的非優(yōu)質胚胎，即5B（4B 或4B 以下）胚胎。

4.內(nèi)膜準備及胚胎移植：內(nèi)膜準備方案包括人工周期和自然周期。月經(jīng)正常的患者于月經(jīng)周期第11天陰道超聲監(jiān)測卵泡發(fā)育，當卵泡直徑≥14mm時開始查血清促黃體生成素（LH），LH 峰值出現(xiàn)后3d行FET；對于月經(jīng)不規(guī)則的患者于月經(jīng)周期第2～3天行陰道超聲監(jiān)測，根據(jù)患者的個體情況決定戊酸雌二醇（補佳樂，先靈，德國）的起始用量，依激素水平調整補佳樂的用量，待超聲監(jiān)測內(nèi)膜≥8mm時肌注黃體酮，具體用藥參考本中心常規(guī)方案［8］。

根據(jù)患者年齡、內(nèi)膜準備情況等決定移植胚胎數(shù)，一般為2～3枚。所有患者在移植后均肌注黃體酮行黃體支持及口服戊酸雌二醇。胚胎移植后14d檢測血β-HCG＞10U／L，2周后B超下見孕囊確定為臨床妊娠。

三、分析指標

本項研究收集并分析了兩組患者年齡、周期數(shù)、不孕年限、體重指數(shù)（BMI）、HCG 日子宮內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、著床數(shù)以及胚胎解凍后繼續(xù)培養(yǎng)的結果等資料。

判斷標準及計算方法：移植前50%以上胚胎卵裂球透亮為胚胎存活［5］；移植時胚胎細胞數(shù)與D3胚胎細胞數(shù)一致或小于D3胚胎細胞數(shù)定義為胚胎未生長；移植時胚胎細胞數(shù)大于D3 胚胎細胞數(shù)或移植時發(fā)育為囊胚定義為胚胎繼續(xù)生長；移植時形成囊胚的比例定義為形成囊胚的胚胎數(shù)／解凍后存活的胚胎數(shù)；胚胎種植率定義為超聲掃描可見孕囊數(shù)／移植胚胎數(shù)；臨床妊娠率定義為臨床妊娠例數(shù)／總周期數(shù)；流產(chǎn)率為流產(chǎn)例數(shù)／臨床妊娠例數(shù)。

四、統(tǒng)計學分析

應用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計數(shù)資料結果以均數(shù)±標準差表示，計量資料以率表示。定量資料比較采用t檢驗，定性資料的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、患者基礎資料及臨床結局

本項回顧性研究共納入346個凍胚移植周期，其中，非優(yōu)質組144個周期，優(yōu)質組202個周期，兩組分別取消了9個和8個周期。

兩組間不孕年限、HCG 日內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；非優(yōu)質組女方年齡明顯高于優(yōu)質組（P＜0.05）（表1）。

二、胚胎解凍后繼續(xù)培養(yǎng)情況

非優(yōu)質組胚胎解凍后存活率為95.86%（324／338），優(yōu) 質 組 胚 胎 解 凍 后 存 活 率96.07%（464／483），組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。兩組因解凍及培養(yǎng)過程中胚胎溶解而取消周期的比例分別為6.25%和3.96%，組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（表2）。

非優(yōu)質胚胎解凍后存活324枚，其中卵裂球繼續(xù)分裂的胚胎238枚（2枚發(fā)育為囊胚），86枚胚胎未生長；優(yōu)質胚胎解凍后存活464枚，其中未生長胚胎72枚，19枚在移植時發(fā)育為囊胚。兩組胚胎未生長比例（26.54%vs.15.52%）和移植時形成囊胚的比例（0.62%vs.4.10%）均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（表2）。

三、兩組患者妊娠結局比較

135個非優(yōu)質胚胎移植周期中，共移植322 枚胚 胎，種 植 率13.66% （44／322），臨 床 妊 娠 率26.67%（36／135），流產(chǎn)率8.33%（3／36）；194個優(yōu)質胚胎移植周期中，共移植459 枚胚胎，種植率30.28%（139／459），臨 床 妊 娠 率51.55% （100／194），流產(chǎn)率為7.00%（7／100）。兩組間種植率、臨床妊娠率均有顯著差異（P＜0.001），而組間流產(chǎn)率無顯著差異（P＞0.05）（表3）。

四、非優(yōu)質胚胎的組成情況及其解凍結局

135個非優(yōu)質胚胎移植周期中，共移植胚胎322枚，其中4B以下胚胎1枚，4B胚胎181枚，5B胚胎140枚。44枚胚胎著床。

5B組胚胎解凍后存活率顯著高于4B 組（P＜0.001）；與4B胚胎組相比，5B胚胎組未生長胚胎的比例較低，而繼續(xù)生長胚胎的比例較高，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（表4）。4B組有2枚胚胎解凍培養(yǎng)后形成囊胚。

五、不同內(nèi)膜準備周期對非優(yōu)質胚胎移植臨床結局的影響

135個非優(yōu)質胚胎移植周期中，35個自然周期，100個人工內(nèi)膜準備周期。人工與自然周期患者的年齡、不孕時間、BMI、移植胚胎數(shù)、妊娠率及種植率均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（表5）。

表1 兩組患者基本資料（±s）

表1 兩組患者基本資料（±s）

注：與非優(yōu)質組比較，＊P＜0.05

組 別 年齡（歲）不孕時間（年）BMI（kg／m2）移植胚胎（枚）內(nèi)膜厚度（cm）原發(fā)不孕（%）繼發(fā)不孕（%）周期取消率（%）優(yōu)質組 30.48±4.23＊ 4.79±3.60 21.85±3.11 2.37±0.57 0.85±0.14 48.45 51.55 3.96非優(yōu)質組32.08±4.39 5.61±3.69 21.37±2.58 2.41±0.56 0.87±0.11 46.67 53.33 6.25

表2 胚胎解凍后繼續(xù)培養(yǎng)情況［n（%）］

表3 患者臨床結局［n（%）］

表4 非優(yōu)質組胚胎的組成情況及解凍結局［n（%）］

表5 非優(yōu)質組不同內(nèi)膜準備方案的臨床結局（±s）

表5 非優(yōu)質組不同內(nèi)膜準備方案的臨床結局（±s）

組 別 周期數(shù) 年齡（歲） 不孕時間（年） BMI（kg／m2） 移植胚胎（枚） 種植率（%） 臨床妊娠率（%）自然周期 35 32.86±2.66 5.91±3.85 21.00±2.40 2.37±0.4 9 14.63 28.57人工周期 100 31.81±4.61 5.50±3.65 21.50±2.64 2.42±0.59 13.33 26.00

討 論

自1983年首例冷凍胚胎復蘇后移植成功分娩活嬰以來，F(xiàn)ET 在輔助生殖技術中越來越受到重視，它不僅能在一定程度上避免中、重度卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生，還能提高累計妊娠率，減少患者經(jīng)濟負擔［9-11］。影響FET 臨床結局的因素有很多，包括胚胎的數(shù)目和質量、婦女年齡、患者子宮內(nèi)膜的容受性等［1-3］。有研究表明，在所有因素中胚胎質量的影響最為顯著［4］。優(yōu)質凍胚的種植率顯著高于非優(yōu)質胚胎凍胚，非優(yōu)質胚胎可能不能耐受凍存過程中降溫及復溫所帶來的損傷［12］，且發(fā)育潛能較差，所以有的中心選擇將非優(yōu)質胚胎丟棄。然而，對于年齡較大及獲卵困難的患者來說，非優(yōu)質胚胎的移植可能是其最好的助孕選擇之一。

在本項研究中，優(yōu)質胚胎移植患者的種植率及臨床妊娠率均較非優(yōu)質胚胎移植者高，且優(yōu)質組移植時形成囊胚的比例也顯著高于非優(yōu)質組，這與國內(nèi)學者研究結果一致［5，13］。在此項研究中，非優(yōu)質組移植時形成囊胚的比例為0.62%，2枚非優(yōu)質胚胎（均為4B 胚胎）發(fā)育為囊胚，其中1 例妊娠。表明D3形態(tài)學評價為非優(yōu)質的胚胎部分仍具有發(fā)育至囊胚的潛能。

胚胎質量較好者耐受胚胎降溫、復溫損傷的能力更強［14］，這可能是5B胚胎存活率顯著高于4B胚胎的原因之一。此項研究結果表明，在非優(yōu)質胚胎周期中，胚胎解凍后繼續(xù)培養(yǎng)，5B 胚胎組的生長發(fā)育情況更好，而5B 以下胚胎繼續(xù)發(fā)育的可能性很低，可能的原因是早期胚胎的發(fā)育依賴于胚胎型基因的激活和母源性遺傳物質適時的表達，而2-細胞期是母型調控向合子型調控過渡的起始時期［15］，因此我們推測5B以下胚胎因為早期卵裂沒有適時發(fā)生，從而影響了胚胎的進一步發(fā)育。梁菊艷等［16］的研究表明，非優(yōu)質周期中有囊胚形成的患者，其妊娠率顯著高于無囊胚形成的患者，提示其胚胎有較好的發(fā)育潛能，妊娠失敗的原因可能包括子宮內(nèi)膜容受性、體內(nèi)激素等方面。

本研究結果表明，解凍前評估為非優(yōu)質的胚胎仍然有繼續(xù)發(fā)育的潛力，移植后仍有著床、繼續(xù)妊娠的可能，表明胚胎的發(fā)育潛能和胚胎形態(tài)并不完全一致。有研究證實胚胎形態(tài)學不能完全反映胚胎的質量，不能預測胚胎發(fā)育的潛能，形態(tài)學評分為優(yōu)質胚胎的胚胎染色體異常的發(fā)生率高達25%［17］。我們的研究中4B以下的胚胎僅移植1枚，關于4B以下胚胎的發(fā)育潛能及冷凍價值需進一步研究。

胚胎移植的內(nèi)膜準備包括自然周期和人工周期。關于不同內(nèi)膜準備方案對FET 妊娠結局的影響存在爭議，在本項研究非優(yōu)質組中兩種內(nèi)膜準備方案的胚胎移植結局沒有統(tǒng)計學差異。

年齡是顯著影響女性生殖能力的一個因素［1］，F(xiàn)ET 患者妊娠率隨著年齡的升高而下降［18］。在本研究中，非優(yōu)質胚胎組患者的年齡顯著高于優(yōu)質組，年齡越大獲得優(yōu)質胚胎的幾率越小。年齡對女性生殖能力的影響主要在于對卵母細胞質量以及子宮內(nèi)膜容受性的影響［19-21］：年齡的增加使卵母細胞非整倍體發(fā)生率也增加，這可能與卵母細胞紡錘體、線粒體老化，細胞非極性增加，同源染色體不分離、姐妹染色單體過早分離等有關［19-20］；且年齡的增加使子宮內(nèi)膜發(fā)生一系列的變化，包括細胞中雌、孕激素受體的減少、內(nèi)膜血流量的減少等，這些變化都可能使內(nèi)膜容受性降低［21］。

總之，本研究表明，部分非優(yōu)質胚胎有繼續(xù)發(fā)育的潛能，患者行非優(yōu)質胚胎移植后可能成功妊娠。由于胚胎形態(tài)學觀察并不能完全客觀準確地反映胚胎的發(fā)育潛能，因此，在輔助生殖過程中，對于年齡較大、卵巢功能減退、獲得胚胎困難的患者，臨床工作者應謹慎對待，在沒有剩余胚胎的情況下，建議將其形態(tài)學評估為5B、4B 甚至更低質量的胚胎冷凍后移植，可以提高這些患者的累積妊娠率，改善臨床結局。

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