miR-218和miR-152在漿液性卵巢癌的表達(dá)及臨床意義

趙立紅，石淑莉，齊秀玲

（河北廊坊市廣陽區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廊坊 065200）

卵巢惡性腫瘤是一種常見的女性生殖器腫瘤，發(fā)病率占婦科腫瘤的25%，其死亡率占據(jù)婦科腫瘤的第一位。上皮性卵巢腫瘤是最常見的卵巢腫瘤，占卵巢惡性腫瘤85%～90%，而其中漿液性卵巢癌占上皮性卵巢癌的75%［1-2］，且75%的患者確診時已是晚期，多伴有腹腔等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，尋找早期卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物顯得尤為重要。

miRNAs是一種高度保守性的非編碼RNA，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲相關(guān)［3-4］。miR-218和miR-152表達(dá)的改變與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。有報道顯示miR-218在腎細(xì)胞癌［5］、膀胱癌［6］中表達(dá)下調(diào)，可抑制卵巢癌細(xì)胞［7］、胃腸癌細(xì)胞［8］的侵襲轉(zhuǎn)移；miR-152在卵巢癌［9］、子宮內(nèi)膜癌［10］、胃癌［11］中呈低表達(dá)，與上述腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但是，miR-218和miR-152在卵巢癌特別是漿液性卵巢癌的研究報道較少。本研究運(yùn)用Real-time PCR方法，以正常輸卵管傘端組織和良性病變組織為對照，檢測了miR-218和miR-152 在正常卵巢組織、良性病變卵巢組織以及漿液性卵巢癌組織的表達(dá)情況，分析探討了其與漿液性卵巢癌病理特征之間的關(guān)系以及在漿液性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

材料和方法

一、研究對象

正常卵巢組織（正常輸卵管傘端上皮組織）、良性病變卵巢組織以及漿液性卵巢癌組織標(biāo)本取自于本院2008年7 月至2012 年2 月行手術(shù)治療的患者，包括漿液性卵巢癌患者50例、良性上皮性卵巢腫瘤患者20 例以及正常卵巢腹腔鏡活檢病例10例。所有患者均簽署知情同意書。

患者術(shù)前均未接受過化療、放療或激素治療，術(shù)后均得到病理確診。組織標(biāo)本離體后10 min內(nèi)置于液氮罐內(nèi)迅速冷凍后置-80 ℃保存。

二、試劑和儀器

Trizol、Taqman miRNA 反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒 以 及TaqMan?MicroRNA Assays（miR-218，Cat ＃4427975；miR-152，Cat ＃ 4366596；U6，Cat ＃4440047）（Life Technologies，美 國）；RNase-free H2O（上海生工）；熒光定量PCR 儀ABI 7500（ABI，美 國）；NanoDrop ＠ND-1000 紫 外 分 光 光 度 儀（NanoDrop，美國）。

三、Real-time PCR

1.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：Trizol法抽提卵巢組織中的總RNA，用TaqMan miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒中反轉(zhuǎn)錄酶和miRNA 特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)（stem-loop）反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行miRNA 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，操作參照說明書進(jìn)行。反應(yīng)體 系 為15μl，包 括3μl 5×反 轉(zhuǎn) 錄 引 物、0.15μl 100mmol／L dNTP和dTTP混合物、1μl反轉(zhuǎn)錄酶、1.5μl 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、0.19μl RNA 抑制劑以及500ng RNA。反應(yīng)條件：16 ℃2min，42 ℃1min，50℃1s，上述3步經(jīng)40個循環(huán)反應(yīng)，再85℃孵育5min。

2.Real-time PCR檢測：應(yīng)用TaqMan MicroRNA試劑盒對合成的cDNA 進(jìn)行實(shí)時定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃1min變性，95℃15s、60℃20s、70 ℃15s，40個循環(huán)，以U6為內(nèi)參照；分別以2-△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，其中，△Ct＝Ct（miRNA）-Ct（U6）。TaqMan?MicroRNA Assays所有miRNA 及內(nèi)參都采用同一個標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)程序。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般資料

組織標(biāo)本來自本院2008年7月至2012年2月行手術(shù)治療的80例患者?；颊卟v資料完整，術(shù)前均未接受放射治療和化療，術(shù)后均經(jīng)病理明確診斷。

50例卵巢癌患者中，年齡29～73 歲，平均53歲，F(xiàn)IGO I期9例、Ⅱ期12例、Ⅲ期27例、Ⅳ期2例；10例正常卵巢組織患者年齡34～69歲，平均55歲；20例良性上皮性卵巢腫瘤組織患者年齡31～71歲，平均57歲。

二、卵巢癌、良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中miR-218和miR-152表達(dá)

漿液性卵巢癌組織中miR-218 的相對表達(dá)量為404.5，顯著低于正常卵巢組織（相對表達(dá)量為598.7）和良性卵巢腫瘤組織（相對表達(dá)量為523.3），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（分別為P＝0.004 和P＝0.000）（圖1A）；漿液性卵巢癌組織中miR-152的相對表達(dá)量為382.9，顯著低于正常卵巢組織（相對表達(dá)量為678.4）和良性卵巢腫瘤組織（相對表達(dá)量為587.3），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（分別為P＝0.003和P＝0.001）（圖1B）。

圖1 miR-218和miR-152在不同卵巢組織中的表達(dá)

三、卵巢癌組織中miR-218和miR-152與臨床病理特征的關(guān)系

miR-218下調(diào)表達(dá)程度與卵巢癌惡性程度、腫瘤分化程度以及腫瘤轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。隨著卵巢癌惡性程度的增高，miR-218 表達(dá)有下降的趨勢，其中III期、IV 期中miR-218表達(dá)顯著低于I期、II期（P＝0.011）；在中低分化癌組織中的miR-218表達(dá)顯著低于高分化癌組織（P ＝0.023）；淋巴轉(zhuǎn)移組miR-218表達(dá)顯著低于無淋巴轉(zhuǎn)移組（P＝0.014）（表1）。

miR-152表達(dá)與卵巢癌組織學(xué)類型、腫瘤分化程度以及腫瘤轉(zhuǎn)移情況均無顯著相關(guān)性（P＞0.05）（表1）。

表1 漿液性卵巢癌患者臨床病理特征與miR-218和miR-152表達(dá)的關(guān)系（±s）

表1 漿液性卵巢癌患者臨床病理特征與miR-218和miR-152表達(dá)的關(guān)系（±s）

注：與臨床病例特征各相應(yīng)組比較，＊P＜0.05

臨床特征 例數(shù) miR-218表達(dá)水平miR-152表達(dá)水平年齡（歲） ≥55 39 405.1±0.614 376.1±0.824 ＜55 11 402.4±1.017 384.6±0.472 TNM 分期 I-II期 40 425.4±1.042＊ 394.9±0.198 III-IV 期 10 320.9±1.021 379.9±0.861有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 是 29 299.5±0.271＊ 397.8±0.104 否 21 549.5±0.613 372.1±1.012細(xì)胞分化程度 高 7 618.5±0.714＊ 406.5±0.121 中-低43 369.6±0.511 379.1±0.638

討 論

卵巢癌是影響女性生命健康的三大惡性腫瘤之一，具有高度侵襲性和致死率的特點(diǎn)［12-13］，尋找有效的診斷及預(yù)后評價指標(biāo)和分子治療靶標(biāo)已成為目前卵巢癌分子腫瘤學(xué)研究熱點(diǎn)。近來miRNAs 成為分子生物學(xué)研究的焦點(diǎn)，目前研究表明，miRNA能夠在多種腫瘤中調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)而影響細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)行為［13-15］。miRNA表達(dá)失調(diào)可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的潛在因素，比如miR-31、miR-100和miR-200的缺失可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，而miR-21、miR-93和miR-199a等miRNA 的過表達(dá)，也可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［14-15］。因此，miRNAs在卵巢癌中異常表達(dá)，在卵巢癌發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮舉足輕重的作用，也是腫瘤早期篩查的潛在生物標(biāo)志物。

研究表 明，miR-218在 腎 細(xì) 胞 癌［5］、膀 胱 癌［6］、頭 頸 鱗 狀 細(xì) 胞 癌［16］、胃 癌［17］、肺 癌［18］和 卵 巢癌［19-21］等多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)。本研究采用Real time PCR 技 術(shù) 檢 測 了 正 常 卵 巢 組 織、良 性 病變卵巢組織以及漿液性卵巢癌組織中miR-218的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-218 在卵巢癌組織中的表達(dá)量明顯低于正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤組織，miR-218 可能作為抑癌基因調(diào)節(jié)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程。

miR-152前體位于人類17 號染色體上，是miR-148／152家族成員之一［20］。miR-152在多種腫瘤中被證實(shí)為腫瘤相關(guān)miRNA，可以影響腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。miR-152 在多種腫瘤如卵巢癌［21-23］、子 宮 內(nèi) 膜 癌［10］、胃 癌［11］呈 低 表 達(dá)，可 通 過作用其靶點(diǎn)DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶1在胃癌中發(fā)揮重要的作用［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-152在卵巢癌組織中的表達(dá)顯著低于正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤組織（P＜0.01），提示miR-152也可能作為抑癌基因調(diào)節(jié)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程。

本研究中也進(jìn)行了miR-218 和miR-152 與臨床病理特征的關(guān)系研究。在與臨床病理特征的相關(guān)性分析中我們發(fā)現(xiàn)，miR-218隨著漿液性卵巢癌的臨床分期進(jìn)展和惡性程度增高如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而表達(dá)降低，表明miR-218表達(dá)與卵巢癌臨床進(jìn)展及轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，與病理分化程度呈正相關(guān)。而miR-152在漿液性卵巢癌中的表達(dá)與其各臨床病理特征之間無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)，提示miR-152可能主要在漿液性卵巢癌的發(fā)生過程中起作用，而與其發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲及預(yù)后等臨床進(jìn)展無關(guān)。

綜上所述，miR-218和miR-152在漿液性卵巢癌組織中的表達(dá)與在正常卵巢組織和良性病變組織中的表達(dá)存在差異，且miR-218表達(dá)水平與患者臨床進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)，提示miR-218和miR-152可能成為潛在的卵巢癌診斷和預(yù)后判斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

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