一種新的活動(dòng)精子濃度計(jì)數(shù)方法

李福平，劉博

（四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，成都 610041）

精子濃度為評(píng)價(jià)男性生育能力最重要的指標(biāo)之一，但由于各實(shí)驗(yàn)室使用檢測(cè)方法不同，實(shí)驗(yàn)室結(jié)果有很大的變異。WHO 推薦的方法為精液標(biāo)本經(jīng)過(guò)稀釋，通過(guò)血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，但發(fā)現(xiàn)該方法檢測(cè)結(jié)果變異較大［1］。隨著Makler板的發(fā)明和計(jì)算機(jī)的普及，計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）是當(dāng)前最方便和常用的方法［2］，由于CASA 濃度測(cè)定由系統(tǒng)軟件決定，檢測(cè)的重復(fù)性和一致性較人工計(jì)數(shù)方法有很大的提高，但參數(shù)選擇范圍大，對(duì)非精子成分識(shí)別能力差，因此，準(zhǔn)確性也會(huì)存在一定范圍的偏差［3］。隨著男科實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控的不斷發(fā)展，已知濃度的乳膠珠溶液逐漸應(yīng)用于精液濃度檢測(cè)的質(zhì)控，但精子是具有運(yùn)動(dòng)功能的特殊細(xì)胞，質(zhì)控珠可以對(duì)計(jì)數(shù)板和重復(fù)性操作進(jìn)行很好的控制，但它不能完全模擬人工或CASA 計(jì)數(shù)精子的過(guò)程，沒(méi)有真正實(shí)現(xiàn)精子濃度檢測(cè)的質(zhì)量控制［4-5］。所以精子濃度的檢測(cè)方法需要進(jìn)一步地發(fā)展和提高，筆者根據(jù)多年的臨床精液檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，將人工計(jì)數(shù)和CASA 相結(jié)合，總結(jié)了一個(gè)快速、準(zhǔn)確和方便的可供臨床使用的精子濃度計(jì)數(shù)方法，稱為“定格法”，并與手工計(jì)數(shù)和CASA 分析系統(tǒng)進(jìn)行比較。

一、材料與方法

1.精液標(biāo)本：均來(lái)自本院男性不育門(mén)診的患者，納入標(biāo)準(zhǔn)為精液參數(shù)均高于參考值低限（WHO第五版［6］）的標(biāo)本?；颊呓?～7d，通過(guò)手淫收集全份精液樣本，放入37℃孵箱，待精液液化后進(jìn)行以下4種方法精子計(jì)數(shù)。

2.計(jì)數(shù)工具：使用的計(jì)數(shù)板為Makler（Sefi-Medical Instrument，Haifa，以色列），池深10μm，可以反復(fù)使用的精子計(jì)數(shù)池。CASA 系統(tǒng)為清華同方圖像檢測(cè)分析系統(tǒng)（CASAS-QH-III），BX-41 光學(xué)顯微鏡（Olympus公司，日本）。

3.活動(dòng)精子CASA 計(jì)數(shù)法：精液液化后立即進(jìn)行檢測(cè)，將5μl混勻精液滴入Makler板，CASA 系統(tǒng)計(jì)數(shù)2次，取平均值表示計(jì)數(shù)結(jié)果。

4.活動(dòng)精子人工快速計(jì)數(shù)法：在精液液化后，取5μl混勻精液滴入Makler計(jì)數(shù)板，可與CASA同步進(jìn)行。根據(jù)精子分布情況，在20倍物鏡下快速計(jì)數(shù)Makler板任意10格，即為精子濃度。

5.活動(dòng)精子定格法計(jì)數(shù)法：取混勻的精液5μl，滴入Makler計(jì)數(shù)板，可與CASA 同步進(jìn)行。Makler計(jì)數(shù)板中央有100個(gè)0.1mm×0.1mm 的小方格，利用CASA 的視頻采集功能，分別在Makler計(jì)數(shù)板上小方格區(qū)域的四角和中央采集5幀圖像，在修正菜單中通過(guò)肉眼計(jì)數(shù)精子個(gè)數(shù)（圖1），隨著計(jì)數(shù)精子格子數(shù)的增加，濃度準(zhǔn)確性也會(huì)增高，按下列公式計(jì)算精子濃度：

圖1 定格法精子計(jì)數(shù)示意圖

6.制動(dòng)精子人工計(jì)數(shù)法：根據(jù)《WHO》第五版推薦精子濃度檢測(cè)方法，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室情況進(jìn)行略微修改。為了減少稀釋標(biāo)本和反復(fù)取樣帶來(lái)的誤差，直接將檢測(cè)完后的標(biāo)本放入65 ℃水浴滅活5min，混勻后加入Makler板計(jì)數(shù)精子濃度。

二、結(jié)果

1.活動(dòng)精子定格法與制動(dòng)精子人工計(jì)數(shù)比較

兩種方法數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗(yàn)，P 值均大于0.05，可認(rèn)為近似正態(tài)分布。定格法與制動(dòng)精子人工計(jì)數(shù)結(jié)果顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），并且有好的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)r＝0.810，P＜0.001）（表1）。

表1 活動(dòng)精子定格法與制動(dòng)精子人工計(jì)數(shù)比較

2.活動(dòng)精子計(jì)數(shù)的3種方法比較

比較活動(dòng)精子定格法、CASA 計(jì)數(shù)法和人工快速計(jì)數(shù)法，3種計(jì)數(shù)方法體現(xiàn)了良好的一致性，3種方法結(jié)果沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。CASA 計(jì)數(shù)法與定格法比較，有極好的一致性（r＝0.957，P＜0.001）。同樣經(jīng)過(guò)定格法培訓(xùn)合格后的工作人員采用人工快速計(jì)數(shù)法計(jì)算結(jié)果有良好的一致性（r＝0.924，P＜0.001）（表2）。

表2 不同活動(dòng)精子計(jì)數(shù)方法的比較

三、討論

精子計(jì)數(shù)為精液常規(guī)分析中最重要的指標(biāo)之一，現(xiàn)在WHO 推薦的方法為精液經(jīng)過(guò)稀釋制動(dòng)后，利用血液計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)［6］。但該方法由于計(jì)數(shù)板的局限性和精液處理步驟繁多，導(dǎo)致結(jié)果重復(fù)性較差，且技術(shù)池深為0.1mm，精子往往處于不同的焦平面上，造成計(jì)數(shù)結(jié)果的誤差［7］。隨著檢測(cè)技術(shù)發(fā)展，精液專用計(jì)數(shù)板如Makler板等的應(yīng)用和普及，同時(shí)出現(xiàn)了CASA，使用精液原液直接進(jìn)行精子濃度和活動(dòng)百分率檢測(cè)變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)，且在分析精子運(yùn)動(dòng)方面也顯示了獨(dú)特的功能［8］。CASA 系統(tǒng)是通過(guò)光電原理，自動(dòng)得到精子濃度、活力等指標(biāo)，并能對(duì)精子運(yùn)動(dòng)軌跡特征畸形分析，CASA 有較好的重復(fù)性和一致性，是當(dāng)前臨床最常用的檢測(cè)方法［9］。然而，由于其參數(shù)選擇范圍較大，對(duì)精子與非精子成分識(shí)別能力較差，會(huì)將顆粒與精子相近的雜質(zhì)當(dāng)做精子計(jì)數(shù)，往往導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果有大的偏差。隨著對(duì)男科實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的認(rèn)識(shí)越來(lái)越高，現(xiàn)有的質(zhì)控方法如使用標(biāo)準(zhǔn)乳膠珠溶液作為質(zhì)控珠，可以檢測(cè)計(jì)數(shù)板，混勻和加樣等操作進(jìn)行質(zhì)量控制，但其不能完全模擬CASA 計(jì)數(shù)精子的過(guò)程，無(wú)法達(dá)到整個(gè)精子計(jì)數(shù)過(guò)程的監(jiān)控。

對(duì)于精子計(jì)數(shù)方法的研究，近年大部分學(xué)者主要集中在對(duì)不同計(jì)數(shù)板對(duì)精子計(jì)數(shù)的影響，如蔡靖等［10］報(bào)道了Makler、Leja和Microcell 3種不同類型的計(jì)數(shù)池對(duì)精子濃度結(jié)果存在明顯的差異。還有人工計(jì)數(shù)與儀器自動(dòng)計(jì)數(shù)之間的對(duì)比研究，如紀(jì)冰［11］比較了常用計(jì)數(shù)板與ISAS檢測(cè)系統(tǒng)之間的差別，胡毓安等［12］報(bào)道了3種計(jì)數(shù)板與CASA 分析系統(tǒng)之間的比較。以上方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，均無(wú)法完全被代替。在選用合格的計(jì)數(shù)板后，如何得出真實(shí)、準(zhǔn)確的精子濃度仍然沒(méi)有行之有效的方法。如前所訴，精液稀釋制動(dòng)后計(jì)數(shù)方法，操作流程多，工作量大，結(jié)果受操作者主觀影響大，不適合臨床常規(guī)檢測(cè)開(kāi)展。使用精液原液人工快速計(jì)數(shù)，雖然方便快捷，但與檢測(cè)者的熟練程度有很大相關(guān)，受操作者的主觀影響更大，結(jié)果往往產(chǎn)生較大的變異。本研究總結(jié)的“定格法”正是在通過(guò)結(jié)合人工計(jì)數(shù)和CASA分析系統(tǒng)的各自特點(diǎn)后提出的較為有效的活動(dòng)精子計(jì)數(shù)方法。原理就是利用CASA 的視頻采集功能在Makler計(jì)數(shù)板視野范圍不同區(qū)域分別采集圖像，通過(guò)人工識(shí)別精子并進(jìn)行計(jì)算，得出精子濃度。計(jì)數(shù)的格子越多，準(zhǔn)確性越高。在本研究中，定格法與制動(dòng)精子人工計(jì)數(shù)比較沒(méi)有顯著性差別（P ＝0.178），表明利用活動(dòng)精子直接計(jì)數(shù)可以代替流程較為繁瑣的制動(dòng)后精子計(jì)數(shù)。用該方法對(duì)CASA 參數(shù)進(jìn)行矯正，人工計(jì)數(shù)快速計(jì)數(shù)進(jìn)行培訓(xùn)，可以使多種檢測(cè)精子方法得到較高的一致性和重復(fù)性（定格法-CASAr＝0.957，定格法-人工快速計(jì)數(shù)r＝0.924）。

定格法不需對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稀釋和對(duì)精子制動(dòng)，直接使用精液原液進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)減少了稀釋和多次加樣帶來(lái)的誤差。定格法可與CASA 和人工快速計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件完全相同，可以對(duì)常用的幾種方法進(jìn)行相互比較，相互補(bǔ)充。該方法簡(jiǎn)便快速，在有CASA 檢測(cè)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室均可開(kāi)展，便于推廣。由于該方法只限于加樣后如何計(jì)數(shù)精子濃度的過(guò)程，無(wú)法避免由于取精不完整、計(jì)數(shù)板差異、混勻不充分和加樣等帶來(lái)的系統(tǒng)誤差。定格法是對(duì)現(xiàn)有的精子濃度檢測(cè)方法的補(bǔ)充和完善，該方法的有效性和實(shí)用性還需要多中心，大樣本量的進(jìn)一步的研究。

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