苓桂術(shù)甘湯含藥血清對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2 中TNF-α、IL-6 和IL-1β 的影響*

許 閃，黃金玲，2，王 靚，2△，施 慧，卲 菁，2，洪星輝，甘賢兵，2，劉 蕾

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥230038；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，安徽 合肥230038）

慢性心力衰竭（CHF）是一種復(fù)雜的臨床癥狀，是各種心臟病的嚴(yán)重階段。目前研究證實(shí)，心室重構(gòu)、內(nèi)分泌及細(xì)胞因子的紊亂是CHF 病理生理過(guò)程發(fā)生發(fā)展的兩大因素[1]。在初始的心肌損傷以后，多種內(nèi)源性的神經(jīng)內(nèi)分泌和細(xì)胞因子系統(tǒng)的激活，進(jìn)一步加重了心肌損傷和心功能惡化[2]。機(jī)體可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，心肌細(xì)胞也成為多種細(xì)胞因子作用的靶細(xì)胞。炎性細(xì)胞因子在慢性心力衰竭中發(fā)揮著重要的作用[3-4]。

課題組前期研究證明，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中LGZGD 可以降低急性心肌梗死心室重構(gòu)模型大鼠血清中TNF-α、IL-6 和ET-1 的含量，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)干預(yù)急性心肌梗死后的心室重構(gòu)[5]；體外實(shí)驗(yàn)中LGZGD 含藥血清可以通過(guò)增加細(xì)胞存活率來(lái)保護(hù)由TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞損傷，通過(guò)改善細(xì)胞凋亡形態(tài)、降低細(xì)胞凋亡率、降低心肌細(xì)胞H9c2 中胱天蛋白酶3 和胱天蛋白酶8 的含量來(lái)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2 的凋亡。實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞H9c2 并通過(guò)TGF-β1的誘導(dǎo)來(lái)建立心肌細(xì)胞H9c2 損傷模型，通過(guò)ELISA 法測(cè)定TNF-α、IL-6 和IL-1β 等含量的變化來(lái)觀察LGZGD 含藥血清對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2 損傷的影響，為CHF 的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞株

清潔級(jí)SD 大鼠，雄性（♂），體質(zhì)量（200 ± 20）g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（皖）2011-002；自由攝食和飲水，室溫控制在20 ～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，定時(shí)通風(fēng)換氣。大鼠心肌細(xì)胞株H9c2 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.2 藥品與試劑

LGZGD 按原方比例（茯苓∶桂枝∶白術(shù)∶甘草=4∶3∶3∶2）參考文獻(xiàn)[6]方法，由安徽省亳州市興和藥業(yè)有限公司提取制成含4.8 g 生藥/g 的干浸膏粉末（批號(hào)：20141223），其中桂皮醛含量9.945 mg·g-1，甘草酸含量：14.71 mg·g-1，密封4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

高糖DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司），胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司），胰蛋白酶（美國(guó)Sigma 公司），人重組TGF-β1（批號(hào)0913209，美國(guó)PEPROTECH公司），TNF-α/IL-6/IL-1β 酶聯(lián)免疫分析試劑盒（批號(hào)20150709，上海谷研實(shí)業(yè)有限公司）。

1.3 儀器

3111 型－恒溫CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司），ATOM 全自動(dòng)酶聯(lián)免疫工作站（意大利MAROCHE），3K15-高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司），SW－CJ系列潔凈工作臺(tái)（AIRTECH，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.4 含藥血清的制備

取清潔級(jí)雄性SD 大鼠50 只，隨機(jī)均分為空白對(duì)照組，按含生藥量分別為L(zhǎng)GZGD 2.1，4.2，8.4 g·kg-1（分別相當(dāng)于臨床成人等效量的0.5，1，2 倍）等4 組，灌胃給藥，10 mL·kg-1，空白對(duì)照組給予等體積的蒸餾水，連續(xù)給藥5d，末次給藥后1 h 各組大鼠無(wú)菌條件下腹主動(dòng)脈取血，3 000 × g，離心15 min 后取血清，56 ℃水浴30 min 滅活補(bǔ)體，同組血清混勻，0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌，－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 檢測(cè)指標(biāo)和方法

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期心肌細(xì)胞H9c2 以3×105個(gè)·mL-1的密度接種于6 孔板中，分成6 組，正常組、模型組、空白血清組、LGZGD 2.1，4.2，8.4 g·kg-1含藥血清組?？瞻籽褰M細(xì)胞以含10% 正常組大鼠血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，LGZGD 含藥血清組細(xì)胞分別用含10% LGZGD 2.1，4.2，8.4 g·kg-1的含藥血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，12 h 后除正常組之外其余各組加入20 ng·mL-1TGF-β1，培養(yǎng)12 h 后收集細(xì)胞上清液，3000×g離心10min，取上清液按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)TNF-α/IL-6/IL-1β 的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS17.0 for windows 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行生物學(xué)分析，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

LGZGD 含藥血清對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)H9c2 心肌細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

ELISA 結(jié)果顯示（表1），與正常組比，20 ng·mL-1TGF-β1作用心肌細(xì)胞H9c2 12 h 后，細(xì)胞中TNF-α、IL-6 和IL-1β 的含量明顯升高（P＜0.01），經(jīng)過(guò)LGZGD 4.2，8.4 g·kg-1預(yù)處理組的H9c2 細(xì)胞TNF-α 和IL-6 的含量顯著下降（P＜0.05、P＜0.01），經(jīng)過(guò)LGZGD 2.1，4.2，8.4 g·kg-1預(yù)處理組的H9c2細(xì)胞IL-1β 的含量也明顯下降（P＜0.05、P＜0.01），以上結(jié)果說(shuō)明LGZGD 含藥血清可以降低由TGF-β1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2 中TNF-α、IL-6 和IL-1β 等含量的升高，對(duì)心肌細(xì)胞H9c2 的損傷有一定的保護(hù)作用。

表1 LGZGD 含藥血清對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量的影響

3 討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β、IL-6 和TNF-α 均可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，并且與心衰的嚴(yán)重程度正相關(guān)[7-9]。TNF-α 是由活化的單核巨噬細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞激動(dòng)劑，可損害血管內(nèi)皮，抑制心肌收縮力[10]，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡或壞死，導(dǎo)致左心室明顯擴(kuò)大，刺激成纖維細(xì)胞增殖，參與心室重構(gòu)的病理過(guò)程[11-13]。IL-1β 可由多種細(xì)胞合成，主要來(lái)源于單核細(xì)胞，血管的平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞也可產(chǎn)生。研究證實(shí)，在CHF 中，IL-1β 可以抑制心肌蛋白質(zhì)合成、促進(jìn)其分解，降低心肌細(xì)胞收縮力；IL-1β 的增加還可促使其他具有負(fù)性肌力作用的細(xì)胞因子釋放增加，如：TNF-α，并與TNF-α 協(xié)同發(fā)揮負(fù)性肌力和細(xì)胞毒效應(yīng)并導(dǎo)致心肌功能的抑制[14]。IL-6 是參與心功能異常調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子，對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，直接損傷心肌細(xì)胞，促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大和加重心室重構(gòu)[15]，抑制心肌細(xì)胞的興奮收縮偶聯(lián)。與此同時(shí)，TNF-α 既可誘導(dǎo)合成IL-1β，又可進(jìn)一步激活I(lǐng)L-6[16]，IL-1β 也可誘導(dǎo)TNF-α 的分泌，并與TNF-α 協(xié)同誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，這3 種細(xì)胞因子相互作用，共同促進(jìn)心室重構(gòu)及CHF 的發(fā)生發(fā)展。

研究結(jié)果表明，TGF-β1作用于心肌細(xì)胞H9c2后，IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量顯著升高，提示TGF-β1可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞H9c2 發(fā)生損傷，而經(jīng)過(guò)LGZGD 2.1，4.2，8.4 g·kg-1預(yù)處理組的H9c2 細(xì)胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量明顯下降（P＜0.05、P＜0.01），表明LGZGD 含藥血清對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞損傷有顯著的保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制細(xì)胞因子過(guò)度激活有關(guān)。

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