熒光光譜法研究奧沙利鉑與溶菌酶的相互作用

陳晨，張洪峰，王樂，魏亞超

河北省邯鄲市中心醫(yī)院藥學(xué)部，河北 邯鄲 056001

奧沙利鉑(oxalip latin)是第三代鉑類化合物，它對(duì)大腸癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞株，包括對(duì)順鉑和卡鉑的耐藥株均有顯著的抑制作用[1]。

為了使抗癌藥物能定位于腫瘤組織釋放而減少對(duì)正常組織帶來的毒副反應(yīng)，選擇蛋白質(zhì)為藥物載體的應(yīng)用日益廣泛[2]。溶菌酶(lysozyme，LYSO)是生物體內(nèi)重要的非特異性體液免疫因子，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等多種藥理作用[3]，能和許多外源性和內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合，運(yùn)載多種藥物。

本文主要采用熒光光譜法研究了奧沙利鉑與LYSO的相互作用，建立結(jié)合的體外模型，探討結(jié)合的緊密程度、結(jié)合模式、結(jié)合部位等問題，所得結(jié)果將為藥物的聯(lián)用以及抗腫瘤藥物靶向載體的選擇提供有利的信息。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑 熒光光譜儀(LS-50B型)；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；pH計(jì)(pHSJ-5實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，上海精科)；CU600電熱恒溫水浴箱(上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

緩沖溶液為p H=7.4，0.05m o l·L-1的T r i s-HCl(內(nèi)含0.1 mol·L-1的NaCl)；LYSO(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)1×10-5m o l·L-1，奧沙利鉑標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100584-200401)1×10-3mol·L-1，均用上述緩沖溶液配制。其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熒光光譜測(cè)定方法 在一系列10mL容量瓶中，加入1m L1×10-5mol·L-1的LYSO溶液和不同量的(0、10、20、30、40、50、60μL)1.0×10-3mol·L-1的奧沙利鉑溶液，用Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度，搖勻、靜置。

熒光發(fā)射光譜：準(zhǔn)確移取3m L含有不同濃度奧沙利鉑的LYSO溶液于石英比色皿中，在298K和310K條件下，分別掃描其熒光發(fā)射光譜。以280nm為激發(fā)波長(λex)，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為7nm，掃描范圍300～420nm。

同步熒光光譜：Δλ=15 nm和Δλ= 60 nm，掃描范圍分別為270～315 nm和250～315 nm。

1.2.2 紫外光譜測(cè)定方法 掃描300～420nm范圍內(nèi)，1.0×10-6mol·L-1的奧沙利鉑溶液的紫外吸收光譜。

2 結(jié)果

2.1 熒光光譜特征 LYSO由129個(gè)氨基酸殘基組成，Trp62和Trp108是LYSO熒光的主要來源[4]。圖1是含有不同濃度奧沙利鉑的LYSO溶液的熒光發(fā)射光譜，從圖中可以看出，隨著奧沙利鉑濃度的增加，LYSO在347 nm處的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸降低，且峰位置發(fā)生了明顯的紅移，表明奧沙利鉑與LYSO發(fā)生了相互作用，LYSO的內(nèi)源性熒光產(chǎn)生猝滅。

2.2 熒光猝滅機(jī)理 根據(jù)猝滅機(jī)理不同，熒光猝滅分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，分別遵循Stern-Volmer方程[1]和Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程[2]：

式中F0為未加入猝滅劑時(shí)LYSO的熒光強(qiáng)度；F為加入猝滅劑后LYSO的熒光強(qiáng)度；Kq為雙分子猝滅過程的速率常數(shù)；τ0為不存在猝滅劑時(shí)熒光分子的平均壽命；Ksv是動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)；KLB是靜態(tài)猝滅常數(shù)；[Q]為猝滅劑的濃度。

以F0/F對(duì)[Q]作圖，得到不同溫度下的Ksv(表1)。對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅，溫度升高有利于猝滅過程進(jìn)行，Ksv隨溫度的升高而增大；而靜態(tài)猝滅，溫度升高形成的復(fù)合物穩(wěn)定性降低，Ksv減小[5]。從表1中看出隨著溫度的升高，Ksv減小，可初步判斷猝滅過程為靜態(tài)猝滅。同時(shí)，各類猝滅劑對(duì)生物大分子的擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)最大不超過 2×1010L·mol-1·s-1[6]，而實(shí)驗(yàn)所得Kq均遠(yuǎn)大于此值，進(jìn)一步證明奧沙利鉑與LYSO之間主要發(fā)生了靜態(tài)猝滅反應(yīng)。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程得到KLB。

2.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù) 根據(jù)結(jié)合和自由的分子建立化學(xué)平衡方程：lg[(F0－F)/F]=lg K a+n lg[Q][3]，得出藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)K a和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，見表2，298K和310K時(shí)，奧沙利鉑與LYSO的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均接近于1，表明二者近似以1:1結(jié)合生成復(fù)合物。

圖1 奧沙利鉑與LYSO相互作用的熒光猝滅圖Fig 1 Fluorescence quenching spectra o f interaction betw een oxalip latin and LYSO C(LYSO)=1.0×10-6m o l·L-1 in all cases; Curve 1→8, C(oxalip latin)/(10-6m o l·L-1):0,1,2,3,4,5,6,7

表1 不同溫度下的K sv和K LBTab1 K sv and K LB at d ifferen t tem peratu re

表2 不同溫度下的結(jié)合常數(shù)(K a)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)Tab2 Bind ing constants(K a) and binding sites(n) at d ifferent tem perature

2.4 非輻射能量轉(zhuǎn)移 根據(jù) F?ster's能量轉(zhuǎn)移原理，如果供能體能夠發(fā)熒光，其熒光發(fā)射光譜與受能體的吸收光譜有足夠的重疊，并且供能體與受能體的最大距離小于7nm，就可認(rèn)為供能體與受體之間發(fā)生了非能量輻射轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致供能體熒光猝滅。臨界能量轉(zhuǎn)移距離(R0)、結(jié)合距離(r)及能量轉(zhuǎn)移效率(E)符合以下關(guān)系[7]：

F(λ)為供能體在波長λ處的熒光強(qiáng)度，ε(λ)為受能體在λ處的摩爾吸光系數(shù)，J是供能體熒光發(fā)射光譜與受能體紫外吸收光譜的重疊積分。偶極空間取向因子K2=2/3，LYSO中色氨酸殘基的量子產(chǎn)率Φ=0.15，介質(zhì)折射指數(shù)n=1.36。計(jì)算得出r=4.53nm，小于7nm。由此推斷奧沙利鉑與LYSO之間發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移，促使了LYSO的熒光猝滅。圖2為奧沙利鉑的紫外吸收光譜與LYSO熒光發(fā)射光譜的疊加圖。

2.5 作用力類型的確定 有機(jī)小分子與生物大分子之間的作用力類型主要有疏水作用力、靜電引力、氫鍵和范德華力等。當(dāng)ΔH>0，ΔS>0時(shí)，分子間的作用力主要是疏水作用力；當(dāng)ΔH<0，ΔS<0時(shí)，主要為氫鍵和范德華力；當(dāng)ΔH<0，ΔS>0時(shí)，靜電引力占主導(dǎo)[8]。當(dāng)溫度變化范圍不大時(shí)，反應(yīng)焓變?chǔ)和熵變?chǔ)可以近似看做常數(shù)。根據(jù)熱力學(xué)方程：

圖2 奧沙利鉑的吸收光譜(1)與LYSO的熒光光譜(2)疊加圖Fig 2 Overlap o f the abso rp tion spectrum o f oxalip latin(1) w ith the fluorescence spectrum of LYSO(2)C(LYSO)=C(oxalip latin)= 1.0×10-6m o l·L-1

求得不同溫度下的熱力學(xué)參數(shù)，見表3。

可以看出，ΔG均小于0，即在298K和310K時(shí)奧沙利鉑與LYSO的相互作用過程都是自發(fā)進(jìn)行的。ΔH<0，ΔS<0，說明奧沙利鉑與LYSO之間主要以氫鍵和范德華力相結(jié)合。

表3 不同溫度下奧沙利鉑與LYSO作用的熱力學(xué)參數(shù)Tab3 Therm odynam ic param eters of the reaction between oxaliplatin and LYSO at different tem perature

圖3 奧沙利鉑與LYSO相互作用的同步熒光光譜Fig 3 Synchronous fluorescence spectra of interaction betw een oxalip latin and LYSO Δλ=15nm(A)andΔλ=60nm(B)T=298 K, C(LYSO)=1×10-6m ol·L-1 in all cases; Curve 1→7, C(oxalip latin)/(10-6m o l·L-1): 0,1,2,3,4,5,6.

2.6 同步熒光光譜 Δλ=15nm和Δλ=60nm分別體現(xiàn)蛋白質(zhì)酪氨酸和色氨酸殘基的光譜特征。氨基酸殘基的最大發(fā)射波長與所處環(huán)境極性密切相關(guān)[9]，根據(jù)最大熒光發(fā)射波長的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。由圖3可以看出，隨著奧沙利鉑濃度的增大，LYSO色氨酸和酪氨酸殘基的熒光發(fā)射峰均產(chǎn)生紅移，說明微環(huán)境的疏水性降低，肽鏈的伸展程度可能增強(qiáng)，氨基酸殘基處于更“暴露”的狀態(tài)中[10]，從而引起了LYSO構(gòu)象的變化。

3 討論

LYSO普遍存在于鳥類、家禽的蛋清和哺乳動(dòng)物的眼淚、唾液、血液、尿液、乳汁和組織細(xì)胞中[11]，是一種天然的無毒副作用的小分子堿性蛋白質(zhì)，奧沙利鉑能與其以氫鍵和范德華力結(jié)合生成復(fù)合物，選擇LYSO作為奧沙利鉑的靶向載體，可能會(huì)減小其對(duì)正常組織的毒副作用，增強(qiáng)抗腫瘤療效。同時(shí)，二者的Ka較小，在血液中較容易分離，奧沙利鉑較容易分布到靶組織以及代謝。

[1] 邱瑾, 邵爽, 游金宗. 熒光法研究奧沙利鉑與牛血清白蛋白的相互作用[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2007, 26(1): 51-54.

[2] 羅曉琴, 朱穎杰, 王成蹊. 熒光光度法研究不同藥物載體制成5- FU納米粒的靶向性[J]. 中國執(zhí)業(yè)藥師, 2010, 7(6): 27-29.

[3] 何金花, 劉譽(yù), 劉冠杰, 等. 溶菌酶在醫(yī)藥中的應(yīng)用及其研究進(jìn)展[J]. 藥學(xué)進(jìn)展, 2008, 18(2): 16-18.

[4] Kalyan Sundar Ghosh, Bijaya Ketan Sahoo, Swagata Dasgupta, et al. Spectrophotometric studies on the interaction between(-)-epigallocatechin gallate and lysozyme[J]. Journal of Chemical Physics Letters, 2008, 452(1): 193-197.

[5] Wenhua Gao, Nana Li, Gaopan Chen, et al. Binding studies of costunolide and dehydrocostuslactone with HASby spectroscopy and atomic force microscopy[J]. Journal of Luminescence, 2011, 131(10): 2063-2071.

[6] Xianyong Yu, Ying Yang, Ronghua Liu, et al. The investigation of the interaction between edaravone and bovine serumalbumin by spectroscopic approaches[J]. Journal of Luminescence, 2011, 131(7): 1510-1514.

[7] Nooshin Abdollahpour, Ahmad Asoodeh, Mohammad Reza Saberi, et al. Separate and simultaneous binding effects of aspirin and amlodipineto human serum albumin based on fluorescence spectroscopic andmolecular modeling characterizations: A mechanistic insight fordetermining usage drugs doses[J]. Journal of Luminescence, 2011, 131(9): 1885-1899.

[8] Min Xu, Feng-Juan Chen, Liang Huang, et al. Binding of rare earth metal complexes with an o f l oxacin derivative to bovineserum albumin and its effect on the conformation of protein[J]. Journal of Luminescence, 2011, 131(8): 1557-1565.

[9] Daojin Li, YeWang, Jianjun Chen, et al. Characterization of the interaction between farrerol and bovine serum albuminby f l uorescence and circular dichroism. Spectrochimica Acta Part A, 2011, 79(3): 680-686.

[10] 張志恒, 李彩瑞, 馬晶軍, 等. 熒光法研究木犀草素與人血清白蛋白的相互作用[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2008, 28(5): 1135-1139.

[11] 李敏. 溶菌酶及其應(yīng)用[J]. 生物學(xué)教學(xué), 2006, 31(4): 2-3.