國內(nèi)外口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3A BC抗體ELIS A檢測方法的比較

王玉玲，張俊哲，王 可，楊春江，譚緒良

（1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津 塘沽 300461；2.天津?yàn)I海新區(qū)塘沽動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津 塘沽 300456）

口蹄疫（Foot and Mouth Disease）是由小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）口瘡病毒屬（Aphthovi?rus）的一種病毒引起，是口瘡病毒屬的惟一成員?？谔阋呤遣溉閯?dòng)物的一種高度接觸性傳染病，典型的臨床特征是在動(dòng)物的蹄、口腔黏膜以及雌性動(dòng)物乳頭上有水皰發(fā)生?？谔阋邔σ赘械呐继銊?dòng)物具有嚴(yán)重的潛在經(jīng)濟(jì)危害，是世界各個(gè)國家主要防范的動(dòng)物疫病之一，是影響國際貿(mào)易的重大疫病之一[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將口蹄疫列為世界各國應(yīng)通報(bào)疫病[2]?？谔阋吣芮趾Χ喾N動(dòng)物，偶蹄動(dòng)物最易感。我國農(nóng)業(yè)部將其列為一類動(dòng)物疫病[3]，并將其列為進(jìn)境動(dòng)物一類傳染病。在出入境動(dòng)物檢疫中口蹄疫是法檢疫病。

由于口蹄疫在臨床上表現(xiàn)的癥狀與其他水皰性疾病，如豬水皰病、水皰性口炎、水皰性皰疹較難區(qū)別，一般都需要通過實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，確認(rèn)動(dòng)物是否感染口蹄疫病毒。實(shí)驗(yàn)室常采用血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行口蹄疫病毒抗體的檢測，血清學(xué)試驗(yàn)包括病毒中和試驗(yàn)、固相競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和非結(jié)構(gòu)蛋白抗體試驗(yàn)。本文是對非結(jié)構(gòu)蛋白抗體試驗(yàn)中的間接ELI?SA檢驗(yàn)試劑盒進(jìn)行比對，同時(shí)與阻斷ELISA檢驗(yàn)方法進(jìn)行比較，以期獲得可應(yīng)用于進(jìn)出境動(dòng)物檢疫和動(dòng)物臨床檢疫的更有效試劑盒和檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體間接ELISA試劑盒（A），由巴西泛美口蹄疫疫病中心提供；口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體間接ELISA試劑盒（B），購自IDEXX公司；?？谔阋叻墙Y(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體間接ELISA試劑盒（C），購自蘭州獸醫(yī)研究所；口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體阻斷ELISA試劑盒（D），購自PrioCHECK公司；口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體EITB試劑盒，由巴西泛美口蹄疫疫病中心提供；口蹄疫弱陽性血清（CP1），2個(gè)批號(hào)，由巴西泛美口蹄疫疫病中心提供；口蹄疫陽性血清（CP2），2個(gè)批號(hào)，由巴西泛美口蹄疫疫病中心提供；水泡性口炎陽性血清，由云南檢驗(yàn)檢疫局提供；牛白血病陽性血清，購自IDEXX公司；鹿流行性出血熱陽性血清，購自VMRD公司；赤羽病陽性血清，購自IDVET公司；牛病毒性腹瀉陽性血清，購自IDEXX公司。

1.2 血清樣品 口蹄疫陽性牛血清樣品共20份，由某單位提供；口蹄疫陰性牛血清樣品共85份，采自進(jìn)境澳大利亞牛、新西蘭牛；烏拉圭牛血清45份。

1.3 A試劑盒口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體間接ELISA檢測方法 按照試劑盒使用說明書進(jìn)行檢測。用樣品稀釋液將血清樣品、弱陽性對照血清（CP1）、陽對照血清（CP2）、陰性對照血清作1∶20稀釋后加入微量反應(yīng)板。450 nm和620 nm（作為自動(dòng)背景校正）雙波長下讀吸光值（OD值）。T/C=（被檢樣品的OD值-CN的OD平均值）/（CP1的OD平均值-CN的OD平均值），當(dāng)T/C＜0.8，樣品為陰性；當(dāng)0.8≤T/C＜1，樣品為可疑；當(dāng)T/C≥1，樣品為陽性。

1.4 B試劑盒口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體間接ELISA檢測方 按照試劑盒使用說明書進(jìn)行檢測。用樣品稀釋液將血清樣品、陽性對照血清、陰性對照血清作1∶100稀釋后加入微量反應(yīng)板。450 nm波長下讀OD值。T/C=（被檢樣品的OD值-陰性對照的OD平均值）/（陽性對照的OD平均值-陰性對照的OD平均值），當(dāng)T/C＜0.2，樣品為陰性；當(dāng)0.2≤T/C＜0.3，樣品為可疑；當(dāng)T/C≥0.3，樣品為陽性。

1.5 C試劑盒口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體間接ELISA檢測方法 按照試劑盒使用說明書進(jìn)行檢測。用樣品稀釋液將血清樣品、陽性對照血清、陰性對照血清作1∶21稀釋后加入微量反應(yīng)板。450 nm波長下讀OD值。T/C=（被檢樣品的OD值-陰性對照的OD平均值）/（陽性對照的OD平均值-陰性對照的OD平均值)，當(dāng)T/C＜0.2，樣品為陰性；當(dāng)0.2≤T/C＜0.3，樣品為可疑；當(dāng)T/C≥0.3，樣品為陽性。

1.6 D試劑盒口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體阻斷ELISA檢測方法 按照試劑盒使用說明書進(jìn)行檢測。用ELISA緩沖液將血清樣品、弱陽性對照血清、陽性對照血清、陰性對照血清作1∶5稀釋后加入微量反應(yīng)板。450 nm波長下讀OD值。PI=100-（被檢樣品的OD值/陰性對照的OD平均值）*100，當(dāng)PI＜50%，樣品為陰性；當(dāng)PI≥50%，樣品為陽性。

1.7 口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體EITB檢測方法按試劑盒使用說明書進(jìn)行檢測。用飽和緩沖液將血清樣品、弱陽性對照血清（CP1）、陽性對照血清（CP2）、陰性對照血清作1∶200稀釋。當(dāng)樣品在3ABC、3A、3B、3D（+/-2C）的著色密度等于或高于CP1對照密度時(shí)，判定為陽性；當(dāng)兩個(gè)或更多非結(jié)構(gòu)蛋白的著色密度低于對照密度時(shí)，判定為陰性。

1.8 敏感性試驗(yàn) 采用1.3、1.4、1.5、1.6、1.7的方法，對20份口蹄疫陽性血清樣品進(jìn)行檢測；將2個(gè)批號(hào)的口蹄疫陽性血清（CP2）分別稀釋成1∶5、1∶10兩個(gè)滴度，樣品編號(hào)為P1、P2、P3、P4，2個(gè)批號(hào)的口蹄疫陽性血清原液編號(hào)為P5、P6，采用1.3、1.4、1.5、1.6、1.7的方法對6份樣品進(jìn)行檢測；同時(shí)對2個(gè)批號(hào)的口蹄疫弱陽性血清（CP1）進(jìn)行檢測，樣品編號(hào)為P7、P8。

1.9 特異性試驗(yàn) 采用1.3、1.4、1.5、1.6、1.7的方法，對85份口蹄疫陰性血清樣品檢測；同時(shí)對水皰性口炎陽性血清、牛白血病陽性血清、鹿流行性出血熱陽性血清、赤羽病陽性血清、牛病毒性腹瀉陽性血清共5份樣品進(jìn)行檢測，樣品編號(hào)為N1、N2、N3、N4、N5。

1.10 臨床應(yīng)用試驗(yàn) 采用1.3、1.4、1.5、1.6、1.7的方法，對45份烏拉圭牛血清樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 敏感性試驗(yàn)檢測結(jié)果

2.1.1 EITB的檢測結(jié)果 20份陽性樣品檢測均為 EITB 陽性，P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8均為EITB陽性，見表1，并以EITB的檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果，來評估3種檢測方法。

2.1.2 A試劑盒口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體間接ELISA檢測結(jié)果 20份陽性樣品中，檢測出20份為陽性反應(yīng)，敏感性為100%（20/20）。P1、P2、P3、P4為陰性，P5、P6、P7、P8為陽性，見表1。

2.1.3 B試劑盒口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體間接ELISA檢測結(jié)果 20份陽性樣品中，檢測出18份為陽性反應(yīng)，2份可疑反應(yīng)，將可疑反應(yīng)視為陽性結(jié)果，則敏感性為 100%（20/20）。P1、P2、P3、P4為陰性，P5、P6、P7、P8為陽性，見表1。

2.1.4 C試劑盒口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體間接ELISA檢測結(jié)果 20份陽性樣品中，檢測出20份為陽性反應(yīng)，敏感性為100%（20/20）。P2、P4為陰性，P1、P3、P5、P6、P7、P8為陽性反應(yīng)，見表1。

2.1.5 D試劑盒口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體阻斷ELISA檢測結(jié)果 20份陽性樣品中，檢測出20份為陽性反應(yīng)，敏感性為100%（20/20）。P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8均為陽性反應(yīng)，見表1。

表1 敏感性試驗(yàn)檢測結(jié)果

2.2 特異性試驗(yàn)檢測結(jié)果

2.2.1 EITB的檢測結(jié)果 85份陰性樣品檢測均為EITB陰性，N1、N2、N3、N4、N5均為EITB陰性，（見表2），并以EITB的檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果，來評估四種檢測方法。

2.2.2 A試劑盒口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體間接ELISA檢測結(jié)果 85份陰性樣品中，檢測出81份為陰性反應(yīng)，4份為陽性或可疑反應(yīng)，特異性為95%（81/85）。N1、N2、N3、N4、N5均為陰性反應(yīng)（見表2）。

表2 特異性試驗(yàn)檢測結(jié)果

2.2.3 B試劑盒口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體間接ELISA檢測結(jié)果 85份陰性樣品中，檢測出85份為陰性反應(yīng)，特異性為100%（150/150）。N1、N2、N3、N4、N5均為陰性反應(yīng)（見表2）。

2.2.4 C試劑盒口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體間接ELISA檢測結(jié)果 85份陰性樣品中，檢測出62份為陰性反應(yīng)，23份為陽性或可疑反應(yīng)，特異性為73%（62/85）。N1、N2、N3、N4、N5均為陰性反應(yīng)（見表2）。

2.2.5 D試劑盒口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體阻斷ELISA檢測結(jié)果 85份陰性樣品中，檢測出84份為陰性反應(yīng)，1份為陽性反應(yīng)，特異性為99%（84/85）。N1、N2、N3、N4、N5均為陰性反應(yīng)（見表2）。

2.3 臨床應(yīng)用試驗(yàn)檢測結(jié)果

2.3.1 EITB的檢測結(jié)果 45份烏拉圭牛血清樣品檢測均為EITB陰性（見表3），并以EITB的檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果，來評估4種檢測方法。

2.3.2 A試劑盒口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體間接ELISA檢測結(jié)果 45份烏拉圭牛血清樣品中，檢測出39份為陰性反應(yīng)，6份為陽性或可疑反應(yīng)，符合率為87%（39/45）（見表3）。

2.3.3 B試劑盒口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體間接ELISA檢測結(jié)果 45份陰性樣品中，檢測出41份為陰性反應(yīng)，4份為陽性或可疑反應(yīng)，符合率91%（41/45）（見表3）。

2.3.4 C試劑盒口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體間接ELISA檢測結(jié)果 45份陰性樣品中，檢測出27份為陰性反應(yīng)，18份為陽性或可疑反應(yīng)，符合率60%（27/45）（見表3）。

2.3.5 D試劑盒口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體阻斷ELISA檢測結(jié)果 45份陰性樣品中，檢測出41份為陰性反應(yīng)，4份為陽性或可疑反應(yīng)，符合率91%（41/45）（見表3）。

表3 臨床應(yīng)用試驗(yàn)檢測結(jié)果

3 討論

3.1 從敏感性試驗(yàn)檢測結(jié)果看，20份陽性樣品中，采用A、B、C、D檢測方法都檢測為陽性或可疑，敏感性都達(dá)到了100%。但從2個(gè)批號(hào)的口蹄疫陽性血清的稀釋樣品檢測結(jié)果看，D的敏感性最高，1∶10稀釋的陽性血清樣品仍可檢測出陽性結(jié)果；C為次之，可檢測出1∶5稀釋的陽性血清樣品；A和B最低，只可檢測出陽性血清原液樣品；4種檢測方法均可檢測出弱陽性血清樣品；B、C、D的敏感性都不低于A。

3.2 從特異性試驗(yàn)檢測結(jié)果看，B的特異性為100%，D為99%，A為 95%，C為73%，B和D的特異性都高于A，C則低于A。對于5份其他牛疫病的陽性血清均檢測為陰性，說明4種檢測方法與該5種疫病無交叉反應(yīng)。

3.3 從臨床應(yīng)用試驗(yàn)檢測結(jié)果看，B和D與EITB的檢測結(jié)果符合性最高，為91%；A的符合性次之，為87%；C的符合性最低，為60%。4種檢測方法與EITB的檢測結(jié)果均不能達(dá)到100%符合。依據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，當(dāng)試驗(yàn)所用測試樣品量比較大時(shí)，符合性結(jié)果會(huì)高于本試驗(yàn)結(jié)果。

3.4 酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移吸附試驗(yàn)（EITB）在南美已廣泛應(yīng)用于牛口蹄疫血清學(xué)監(jiān)測，用以評估動(dòng)物流動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)。目前程序是間接ELISA作3ABC抗體的篩選性試驗(yàn)，如果樣品為陽性或可疑結(jié)果，再用EITB確定。在大量樣品進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查時(shí)，建議結(jié)合使用間接ELISA法作為初篩，再用EITB進(jìn)行確定[1]。此程序也是OIE《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊》介紹的口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測程序。本文測試樣品的檢測結(jié)果以EITB為標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果也是基于此程序。

3.5 A盒和EITB試劑盒都是由巴西泛美口蹄疫疫病中心自制的，該中心口蹄疫實(shí)驗(yàn)室是OIE參考實(shí)驗(yàn)室，目前我國是參照南美的程序?qū)臑趵巛斎氲哪膛＿M(jìn)行口蹄疫血清學(xué)檢測，檢測用試劑盒由巴西實(shí)驗(yàn)室提供，現(xiàn)從國內(nèi)還無法購買其生產(chǎn)的試劑盒。為了更好的開展國內(nèi)口蹄疫檢疫和監(jiān)測工作，嘗試尋找到一個(gè)檢測效果可以與之相符或更好的試劑盒，對實(shí)際檢測工作尤為必要。

3.6 從本文的比對結(jié)果看，B、C、D的敏感性都不低于A，可以說該3種市售的試劑盒作為篩選性試驗(yàn)的檢測效果與巴西生產(chǎn)的試劑盒相當(dāng)。C的敏感性要高于A，是由國內(nèi)生產(chǎn)的，價(jià)格較低，C與A都屬于間接ELISA方法，可以替代A進(jìn)行大量樣品的篩選性試驗(yàn)。但由于C的特異性不強(qiáng)，因此還需進(jìn)行初篩陽性樣品的確證試驗(yàn)。從比對結(jié)果看，D的敏感性100%、特異性99%、符合性91%，與EITB檢測結(jié)果相比較，其綜合評價(jià)是最高的，采用D替代EITB進(jìn)行血清學(xué)確證試驗(yàn)是可行的。當(dāng)然，從比對結(jié)果看，D的敏感性也高于A，可以直接使用D進(jìn)行口蹄疫血清學(xué)檢測和監(jiān)測。

[1]世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）.陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊[M].5版.北京：農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局，2004：96.

[2]http://web.oie.int/eng/maladies/en_classification2011.htm.

[3] http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/200812/t20081223_1194404.htm.一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告（第1125號(hào)）.