某奶牛場(chǎng)細(xì)菌混合感染的診斷及藥敏試驗(yàn)

李曉娜，許立華，王桂琴

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

鏈球菌病是主要由β溶血性鏈球菌引起的多種人畜共患病的總稱。可引起人類的胸膜炎、敗血癥等,導(dǎo)致嚴(yán)重疾患，甚至死亡[1]。巴氏桿菌病是一種由多殺性巴氏桿菌引起多種畜禽、野生動(dòng)物及人類的敗血性傳染病，以高熱、肺炎、急性胃腸炎及內(nèi)臟廣泛出血為主要特征[3-5]。內(nèi)蒙古鄂爾多斯市某奶牛場(chǎng)為了擴(kuò)充牛群數(shù)量，2013年6月份自陜西省部分牛場(chǎng)購入犢牛及成年母牛。自當(dāng)年7月份有部分牛表現(xiàn)明顯的呼吸道癥狀，發(fā)熱、咳嗽或鼻腔分泌物顯著增多，并在2周左右的時(shí)間里，有1頭犢牛及2頭成年母牛相繼發(fā)生死亡，隨后牛場(chǎng)采集病死牛的肺臟、心臟、肝臟、脾臟等臟器組織送到寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)傳染病實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)以確定引起本場(chǎng)奶牛發(fā)病的病原，通過藥敏試驗(yàn)為該場(chǎng)選擇抗菌藥物給予指導(dǎo)。報(bào)告如下。

1 材料與設(shè)備

1.1 病料采集 自發(fā)病牛場(chǎng)采集3頭發(fā)病牛（1頭犢牛，編號(hào)為1；2頭成年母牛的編號(hào)分別為2、3）的肺臟、心臟、肝臟、脾臟、淋巴結(jié)等臟器組織。

1.2 主要培養(yǎng)基、試劑及主要儀器設(shè)備 普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂基礎(chǔ)、脫纖維羊血，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；微量生化發(fā)酵管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；無菌操作臺(tái)由蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)；電熱恒溫培養(yǎng)箱由上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；高壓滅菌鍋由上海申安醫(yī)療機(jī)械廠生產(chǎn)；顯微鏡由南京江南光電股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 藥敏紙片 頭孢他啶、頭孢曲松、慶大霉素、頭孢氨芐、頭孢脞啉、頭孢拉啶、多西環(huán)素、氨芐西林、阿米卡星、氧氟沙星、恩諾沙星、頭孢呋辛鈉、鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素和新霉素，均購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 流行病學(xué)調(diào)查 對(duì)牛群發(fā)病情況如發(fā)病牛年齡、傳染源及傳播途徑、發(fā)病率及病死率等進(jìn)行調(diào)查。

2.2 病理學(xué)觀察 結(jié)合牛場(chǎng)技術(shù)人員對(duì)病牛的癥狀描述，對(duì)送檢的病料進(jìn)行顏色、質(zhì)地、形狀等大體病變的觀察與記錄，做出初步的病理學(xué)診斷。

2.3 微生物學(xué)診斷

2.3.1 涂片鏡檢 取自3頭牛的肺臟、肝臟、脾臟等臟器組織的新鮮切面，直接涂片，革蘭染色后，在光學(xué)顯微鏡（油鏡）下進(jìn)行觀察，記錄細(xì)菌的染色特性、形狀、大小、排列及分布等特征。

2.3.2 接種培養(yǎng) 對(duì)取自3頭牛的肺臟、肝臟、脾臟、淋巴結(jié)等臟器組織分別接種到麥康凱培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、血液瓊脂等培養(yǎng)基上，37℃溫箱培養(yǎng)18～24 h，觀察并記錄細(xì)菌的生長(zhǎng)情況、菌落特征等培養(yǎng)特性。隨后分組對(duì)不同形態(tài)典型菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

2.3.3 生化試驗(yàn) 用接種針分別挑取純培養(yǎng)的細(xì)菌，接種于葡萄糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、山梨醇等微量生化發(fā)酵管中，37℃進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

2.4 致病菌的藥敏試驗(yàn) 分別挑取自各臟器分離培養(yǎng)的細(xì)菌純培養(yǎng)物接種于生理鹽水中調(diào)制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，然后用滅菌脫脂棉簽蘸取菌懸液涂布于MH瓊脂平板上和加血的MH瓊脂平板上，待瓊脂表面稍干，用消毒鑷子正確貼放藥敏紙片，每塊平板最多貼5片。最后將貼好藥敏紙片的平板置37℃溫箱中培養(yǎng)24 h，取出觀察結(jié)果并記錄。通過測(cè)量各紙片的抑菌圈（mm）大小，參照美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）提供的判斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，確定耐藥順序，進(jìn)而篩選預(yù)防與治療本病的首選藥物。

3 結(jié)果

3.1 流行病學(xué)調(diào)查 自2013年6月從外省購入牛后，該牛場(chǎng)除引進(jìn)牛外，原來牛群不同年齡段奶牛均有發(fā)病表現(xiàn)。因此懷疑此類疾病可通過消化道或呼吸道進(jìn)行傳播。牛群平均發(fā)病率為1.26%，且有病死牛。

3.2 病理學(xué)觀察結(jié)果 1號(hào)病牛肺臟體積顯著腫大，漿膜內(nèi)有出血現(xiàn)象，肺臟實(shí)質(zhì)有多處干酪樣壞死；肺門淋巴結(jié)腫大、充血；肝臟、脾臟等病變不明顯；2號(hào)病牛肺臟體積顯著腫大，肺間質(zhì)顯著增寬，在肺表面或切面有空泡分布，呈現(xiàn)明顯肺氣腫；乳腺質(zhì)地堅(jiān)實(shí)；肺門淋巴結(jié)腫大、充血；心肌表面呈現(xiàn)多處白色、結(jié)締組織增生樣病變；肝臟、脾臟等病變不明顯；3號(hào)病牛肺臟呈灰白色、質(zhì)地堅(jiān)實(shí)、出現(xiàn)明顯肺萎縮；乳腺質(zhì)地堅(jiān)實(shí)，部分區(qū)域的切面呈現(xiàn)干酪樣壞死。肝臟、脾臟等病變不明顯。

3.3 微生物學(xué)診斷結(jié)果 染色鏡檢：發(fā)現(xiàn)有革蘭陽性菌，呈圓形或卵圓形，單個(gè)或呈雙鏈狀；另一種革蘭陰性菌，細(xì)小短桿菌、兩端鈍圓、近似橢圓形、兩極著色明顯。培養(yǎng)特性：在血液瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，平板上長(zhǎng)出灰白色、表面光滑、邊緣整齊的小菌落；另外還出現(xiàn)一種光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、淡灰白小菌落，無溶血現(xiàn)象，折光檢驗(yàn)時(shí)呈現(xiàn)藍(lán)綠色。在普通培養(yǎng)基及其他培養(yǎng)基上生長(zhǎng)均不良。

兩種純培養(yǎng)細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 兩種純培養(yǎng)菌生化試驗(yàn)結(jié)果

由表1結(jié)果可見，生化反應(yīng)結(jié)果與鏈球菌生化反應(yīng)特點(diǎn)相符[7-8]；表2生化反應(yīng)結(jié)果與巴氏桿菌反應(yīng)特點(diǎn)相符[9]。

3.4 敏感藥物篩選結(jié)果 在對(duì)發(fā)病奶牛各臟器分離培養(yǎng)的細(xì)菌純培養(yǎng)物進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌對(duì)阿米卡星、頭孢他啶、頭孢曲松敏感性較高。據(jù)反饋，所選用的藥物臨床治療效果較好。在用藥一個(gè)療程之后，癥狀輕的病牛痊愈，癥狀嚴(yán)重的病牛病情逐漸好轉(zhuǎn)，精神、食欲也回復(fù)正常，牛群中也沒有再出現(xiàn)病死牛，病情得到有效控制。

4 討論

結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查、病理學(xué)特征、染色鏡檢可初步判斷為巴氏桿菌和鏈球菌的混合感染，再經(jīng)培養(yǎng)特性及生化試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，可確診此次發(fā)病是由巴氏桿菌和鏈球菌混合感染所引發(fā)。基于藥敏試驗(yàn)結(jié)果，建議該場(chǎng)針對(duì)此次發(fā)病，可選擇的治療藥物為阿米卡星、頭孢他啶、頭孢曲松等。

健康牛的上呼吸道中常有巴氏桿菌和鏈球菌存在,一般情況下不會(huì)引起牛的發(fā)病。但是，當(dāng)牛群因寒冷、季節(jié)交替、氣候劇變,過度勞累,長(zhǎng)途運(yùn)輸或饑餓等應(yīng)激而降低抵抗力時(shí)即可發(fā)生內(nèi)源性感染[10]。引發(fā)疾病后,病原體的毒力會(huì)增強(qiáng),并且會(huì)隨著分泌物和排泄物排出體外,從而污染飼料、飲水、用具、牧地及環(huán)境等,以致引起其他健康牛的感染。

該奶牛場(chǎng)在本次牛群發(fā)病之前，一直保持良好的管理及運(yùn)營(yíng)狀態(tài)，牛群中犢牛及成年母牛的各種疾病的發(fā)病率一直處于較低水平。由于擴(kuò)充牛群規(guī)模而從外地購入一批牛，但對(duì)于引進(jìn)牛的檢疫措施沒能注重，使得這批牛及混群后所在的牛群中均出現(xiàn)發(fā)病，并有一定的病死率。這就提示與建議牛場(chǎng)堅(jiān)持自繁自養(yǎng),必須引進(jìn)種畜時(shí)，都應(yīng)從無疫病區(qū)選牛，引進(jìn)時(shí)必須做好檢驗(yàn)檢疫工作，確保無疫病后方可進(jìn)場(chǎng)。并在并群前進(jìn)行3～4周的隔離觀察，確保無異常情況時(shí)方可混群飼養(yǎng)。

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