合成肽抗原在豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒抗體檢測中的應(yīng)用

劉博奇，陳善真，陳克宏，羅 均，王志花，王貴平，李其昌

（廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣東 廣州 511400）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS）是由PRRSV直接引發(fā)的一種高度接觸性傳染病，其重要流行特征為持續(xù)性感染，呈地方流行性。2007年4月，農(nóng)業(yè)部頒布《高致病性豬藍耳病防治技術(shù)規(guī)范》開始將高致病性藍耳病納入國家重大動物疫病政府強制性免疫范圍。PRRSV的防治和凈化需要安全高效的疫苗以及相關(guān)檢測技術(shù)的配合使用，因此隨著對藍耳病研究的深入，研制更為精確的抗原用作藍耳病疫苗及相關(guān)免疫診斷試劑越來越被重視。

本試驗利用已篩選的PRRSV偶聯(lián)多肽為抗原，建立了具有高特異性和敏感度的ELISA方法，為臨床豬血清樣品藍耳病抗體檢測提供了科學(xué)有效的快速檢測手段。

1 材料與方法

1.1 試劑 3，5′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、聚葡糖糖胺、EDC均為Sigma公司產(chǎn)品；羊抗豬IgGHRP為美國KPL公司產(chǎn)品；PRRS陽性高免血清由廣東永順生物制藥有限公司饋贈；PRRS陰性血清由廣東某實驗動物中心提供。

1.2 多肽的篩選、合成、偶聯(lián) 參考已發(fā)表文獻，應(yīng)用生物信息學(xué)方法對PRRSV ORF3蛋白的抗原表位進行預(yù)測，確認(rèn)其抗原決定簇（epitopes）篩選出1條針對美洲型抗體位點的PRRS基因序列，由生物公司進行多肽合成及純化。取已合成純化的多肽10 mg溶于50μL DMSO，加入10 mL雙蒸水；稱取1 mg聚葡糖糖胺溶于1 mL PBS中，于多糖溶液內(nèi)加入10 mg EDC偶聯(lián)劑，混勻，最后與多肽溶液混合，室溫下攪拌反正3 h。使用透析袋（MWCO10000-12000）透析6～8 h，除去未結(jié)合的偶聯(lián)劑及游離多肽，將透析后的液體純化、凍干即得偶聯(lián)多肽。

1.3 ELISA操作方法 偶聯(lián)多肽用碳酸鹽緩沖溶液稀釋并包被96孔酶標(biāo)板，100μL/孔，4℃包被過夜。次日取出用PBST洗滌3次，拍干；每孔加入150 μL封閉液，37℃封閉1 h，PBST洗滌3次，拍干，4℃保存?zhèn)溆?；用抗體稀釋液稀釋待檢測血清樣品及陰、陽性血清，室溫孵育30 min，PBST洗滌6次，拍干；100μL/孔加入用HRP穩(wěn)定液1∶4000稀釋的羊抗豬IgG-HRP，室溫孵育30 min，PBST洗滌6次，拍干；每孔加入100μL TMB底物顯色液，室溫避光顯色10min后加入50μL/孔終止液終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀測定其OD450nm值。血清樣本抗體效價（S/P）=（OD450nm樣品-OD450nm陰性）/（OD450nm陽性-OD450nm陰性），根據(jù)其S/P值確定每份樣品的抗體效價，待測樣品效價大于臨界值的判定為陽性，小于臨界值的判定為陰性。

1.4 ELISA最佳工作條件的確定 以0.125～1μg/mL的偶聯(lián)多肽作為抗原包被酶標(biāo)板，將PRRS陰、陽性血清分別按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80進行稀釋，羊抗豬IgG-HRP二抗做1∶2000、1∶4000、1∶6000、1∶8000四個稀釋度，進行ELISA反應(yīng)條件優(yōu)化；分別將陽性和陰性O(shè)D450nm值記為S、N，計算S/N值，取S/N值最大且陽性血清OD450nm值接近1.0時各樣品稀釋度為最佳，用以確定抗原濃度、血清稀釋度及HRP的最佳工作濃度。

1.5 陰陽性臨界值的確定 用建立的ELISA方法檢測臨床采集的70份豬藍耳病陰性血清樣品，計算其平均OD450nm值（-X）和標(biāo)準(zhǔn)方差（SD）；根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原則，樣本OD450nm值≥（-X）+2SD時，即可在99.9%的水平上判定為陽性。

1.6 特異性試驗 利用該方法對豬瘟病毒（HCV）、圓環(huán)病毒2型（PCV-2）、O型口蹄疫病毒（FMDV）和豬偽狂犬病病毒（PRV）等豬陽性血清樣品進行檢測，觀察該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗 用自建ELISA方法檢測已按1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000系列稀釋的陽性樣品，每個樣品做2個重復(fù)孔，并用美國IDEXX豬藍耳病抗體檢測試劑盒做對比參照，用來鑒定該方法的敏感度。

1.8 符合率試驗 用自建ELISA方法對160份已知陰、陽性血清（陰、陽性血清各80份）進行檢測，并與美國IDEXX豬藍耳病抗體檢測試劑盒的檢測結(jié)果進行對比分析，計算二者的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA最佳工作條件 由方陣ELISA測定結(jié)果取S/N最大、且陽性血清OD450nm值接近1.0時的濃度為最佳，結(jié)果見表1。合成肽抗原最佳包被濃度為0.5μg/mL，血清最佳稀釋度為1∶40，HRP最佳稀釋度為1∶4000。

表1 ELIS A最佳工作條件 （S/N）

2.2 陰、陽性判定的臨界值 對70份陰性豬血清樣本進行檢測，結(jié)果見表2。計算其平均OD450nm值（-X）為0.1172，標(biāo)準(zhǔn)方差（SD）為0.0665，計算陰、陽性血清臨界值為-X+2SD=0.2502，因此將0.25判定為血清陰、陽性的界限，即根據(jù)血清樣本S/P=（OD450nm值樣品-OD450nm值陰性）/（OD450nm值陽性-OD450nm值陰性）確定每份樣本的抗體效價，當(dāng)S/P≥0.25時判定為抗體陽性，S/P＜0.25時判定為抗體陰性。

2.3 特異性試驗結(jié)果 用自建ELISA方法對豬瘟病毒（HCV）、圓環(huán)病毒2型（PCV-2）、O型口蹄疫病毒（FMDV）和豬偽狂犬病病毒（PRV）等豬陽性血清樣品進行檢測，每個樣品重復(fù)3個孔，由表3結(jié)果可見HCV、PCV-2、FMDV、PRV等陽性血清均不與PRRS多肽抗原發(fā)生反應(yīng)，表明已篩選出的PRRS多肽抗原具有良好的特異性。

表2 陰性血清樣本的OD值

表3 特異性試驗結(jié)果

2.4 敏感性試驗結(jié)果 用自建ELISA方法對1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000系列稀釋的陽性血清樣品進行檢測，每個樣品做2個重復(fù)孔，并用美國IDEXX豬藍耳病抗體檢測試劑盒做對比參照，見表4結(jié)果可知，陽性血清稀釋度為1∶1000時仍可檢測出PRRS抗體陽性，表明本抗體檢測試劑盒的最低檢測限量為1∶1000，同時用IDEXX試劑盒在陽性血清稀釋度為1∶1000時檢測PRRS抗體亦為陽性。

表4 敏感性試驗結(jié)果

2.5 符合試驗結(jié)果 用自建ELISA方法分別對已知的陰、陽性血清各80份進行檢測并與IDEXX檢測結(jié)果進行對比：IDEXX檢測血清呈陽性為80份、陰性80份，與已知陰、陽性結(jié)果相符；自建多肽檢測血清呈陽性為84份、陰性76份，其中與IDEXX同為陽性73份、陰性69份，假陽性11份、假陰性7份。二者的總體符合率為88.75%。

3 討論

近年來伴隨著政府對于扶持養(yǎng)豬業(yè)出臺的一系列政策，規(guī)?；i場的數(shù)量也越來越多，對高致病性藍耳病的防治尤為關(guān)鍵，在做好計劃免疫的同時，也要定期對豬群進行PRRSV抗體檢測，以便及時了解豬藍耳病的活躍情況及免疫情況。目前對于PRRSV抗體的檢測有多種方法，其中，ELISA方法具有操作簡便、快速、敏感且標(biāo)準(zhǔn)化，尤其適合用于疫病檢測和流行病學(xué)調(diào)查研究，因此被廣泛用于臨床血清學(xué)抗體的檢測。由于國內(nèi)常見的豬藍耳病多為美洲型，因此本試驗中，我們通過多肽篩選，最終合成了一條針對美洲型抗體位點的特異性多肽序列，通過偶聯(lián)技術(shù)將多肽偶聯(lián)后作為抗原包被酶標(biāo)板，經(jīng)過一系列試驗優(yōu)化后確定其最佳的抗原包被濃度、一抗及二抗的稀釋度等條件。本試驗對酶標(biāo)板的選取、ELISA封閉液、抗體稀釋液和底物液的配制均進行了長時間的摸索和研究，使之不僅最大程度的降低了非特異性干擾反應(yīng)，也保證了其試劑的穩(wěn)定性；建立的ELISA方法具有很好的檢測敏感度及特異性，與美國IDEXX豬藍耳病抗體試劑盒的符合率試驗可達88.75%。由于進口試劑盒價格昂貴，而通過此方法為轉(zhuǎn)化一種經(jīng)濟、敏感、穩(wěn)定的應(yīng)用試劑盒打下了重要基礎(chǔ)。

表5 符合率試驗結(jié)果

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