正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選紅藍(lán)草多糖提取工藝研究

韋 正洪海梅潘立衛(wèi)蔣利榮

（1.河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 宜州 546300；2.微生物及植物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 宜州 546300；3.桂西北特色資源研究與開發(fā)廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 宜州 546300）

正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選紅藍(lán)草多糖提取工藝研究

韋 正1，2，3洪海梅1，2，3潘立衛(wèi)1，2，3蔣利榮1，2，3

（1.河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 宜州 546300；2.微生物及植物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 宜州 546300；3.桂西北特色資源研究與開發(fā)廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 宜州 546300）

采用硫酸-苯酚法測(cè)定紅藍(lán)草多糖的含量，用正交設(shè)計(jì)法篩選和優(yōu)化紅藍(lán)草多糖的提取工藝。以料液比、提取時(shí)間、溶液的pH值、提取溫度作為因素，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。各因素對(duì)提取紅藍(lán)草水溶性多糖的影響為：提取溫度＞料液比＞提取溶劑pH值＞提取時(shí)間。確定較優(yōu)提取工藝為料液比為1:40（m:v），提取溫度100℃，提取時(shí)間為2h，提取溶劑pH值4.5，在該工藝條件下，紅藍(lán)草多糖的得率為8.018%，說明紅藍(lán)草除了主成分紫藍(lán)素類、黃酮類外，其多糖的含量也較高。

紅藍(lán)草；多糖；提取工藝

紅藍(lán)草Peristrophe roxburghiana(Schult.)Bremk.，為爵床科紅絲線草屬植物[1]，又名紅絲線，其汁液為天然染料之一[2]。紅藍(lán)草具有清肺止咳，涼血止血，散瘀止痛等作用，其主要含有多糖、生物堿、黃酮類、三萜、甾體及其苷類、苯丙素類、揮發(fā)油、醌類化合物、醇、有機(jī)酸等化學(xué)成分[3-10]。在研究的藍(lán)草多糖提取工藝文獻(xiàn)報(bào)道較少，大都報(bào)道研究其總黃酮及色素的提取工藝，故本文擬以正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選出合理較佳的多糖提取工藝條件，旨為紅藍(lán)草的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent Cary 8454 UV-Vis二極管陣列分光光度計(jì)(美國(guó)Agilent公司)；電子分析天平AE240S (十萬(wàn)分之一)， BP121S(萬(wàn)分之一)( 梅特勒-托利多儀器有限公司)；SSY-4型電子恒溫水浴鍋 (北京泰克儀器有限公)；pH計(jì)pHS-3B型(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；SB25-12D 型超聲波清洗器 ( 寧波新藝超聲設(shè)備有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵SHB-III型(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)易有限公司)。

1.2 材料

苯酚、95%乙醇、甲醇、濃硫酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，所用水為去離子水，其他試劑均為分析純。葡萄糖對(duì)照品對(duì)照品(均購(gòu)于成都曼斯特生物制品公司，純度均＞98%，批號(hào)為A00308-20)。紅藍(lán)草藥材采購(gòu)于宜州市十字街藥材市場(chǎng)，經(jīng)河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院植物學(xué)覃國(guó)樂副教授鑒定為爵床科紅絲線草屬植物Peristrophe roxburghiana(Schult.)Brem紅藍(lán)草。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅藍(lán)草的預(yù)處理

將烘干的紅藍(lán)草粉碎后過80目篩，備用。取一部分用95%乙醇浸提2h進(jìn)行脫脂，抽濾，在60℃恒溫烘干24h后，放于干燥器中備用

2.2 紅藍(lán)草多糖的含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

取葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加水制成每1mL含0.100mg的溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

取藥材粉適量1.0g，精密稱定，置250ml圓底燒瓶中，加水20ml，100℃下回流提取90min，趁熱過濾，溶液定容至250ml，即得。

2.2.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定

將葡萄糖對(duì)照品與供試品經(jīng)苯酚-濃硫酸處理后，于400～600nm波長(zhǎng)下掃描，結(jié)果對(duì)照品與供試品均在490nm處有最大吸收，故選取490nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml，置于具塞試管中，加水補(bǔ)足至2ml，搖勻，加5%苯酚溶液1ml，搖勻，再迅速加入濃硫酸5ml，搖勻，放置10min，于90℃水浴保溫15min，取出，冷水迅速冷卻，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程y=52.484x-0.0306，R=0.9991，結(jié)果表明葡萄糖在線性范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

多糖含量（%）=(A-0.0306)/52.484*8/0.3*250/1000/ m*100%，

式中：A為供試品溶液的吸光度值（ABS）、m為供試品藥材取樣量（g）。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品溶液1.0mL，照“2.2.4”的方法，自“加水補(bǔ)足至2mL”起，依次顯色、測(cè)吸光度值，重復(fù)測(cè)定吸光度值6次，計(jì)算吸光度值的RSD為0.67%，表明精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取藥材粗粉約1.0g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，取0.3mL供試品溶液，照“2.2.4”的方法，自“加水補(bǔ)足至2mL”起，依次顯色、測(cè)吸光度值，在0、0.5、1、2、6、12h分別測(cè)定吸光度值，測(cè)得多糖含量的RSD為1.32%。實(shí)驗(yàn)表明樣品溶液在12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3 單因素考察

2.3.1 料液比考察

取藥材粉約1.0g，精密稱定6份，置圓底燒瓶中，加入不等量蒸餾水1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1：40；100℃下回流提取2h，趁熱過濾，定容至250ml，取2ml定容至25ml，得樣品溶液，取0.4ml樣品溶液，照“2.2.4”的方法，自“加水補(bǔ)足至2ml”起，依次顯色、測(cè)吸光度值。由圖1 可知，料液比為30倍之后，紅藍(lán)草多糖提取率趨于平緩，選擇適宜料液比為1:30。

圖1 料液比考察結(jié)果

2.3.2 提取時(shí)間考察

取藥材粗粉約1.0g，精密稱定6份，置燒瓶中，加入20mL蒸餾水，100℃條件下回流提取不同時(shí)間后，趁熱過濾，濾液定容至250ml容量瓶，取2mL定容至25mL，得樣品溶液，取0.3mL樣品溶液，照“2.2.4”的方法，自“加水補(bǔ)足至2mL”起，依次顯色、測(cè)吸光度值。從圖2可以看出，提取時(shí)間對(duì)紅藍(lán)草多糖提取率影響較弱，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率呈平緩的趨勢(shì)，選擇適宜的提取時(shí)間為2h。

圖2 提取時(shí)間考察結(jié)果

2.3.3 提取溫度考察

從圖3可以看出，隨著浸提溫度的升高，多糖提取率逐漸增大，當(dāng)溫度上升為100 ℃時(shí)，多糖提取率達(dá)到最高。因此，最佳提取溫度為100℃，紅藍(lán)草多糖的提取率最佳。

圖3 提取溫度考察結(jié)果

2.3.4 提取溶劑pH值考察

不同溫度條件下回流提取，結(jié)果得出在提取溶劑pH值為4.5條件下，紅藍(lán)草多糖的提取率最佳，如圖4所示。

圖4 提取溶劑pH值考察結(jié)果

2.3.5 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增加，多糖的提取率呈平滑上升趨勢(shì)，但提取次數(shù)超過1次后多糖提取率增加緩慢，因此， 選擇最適提取次數(shù)為1次。

圖5 提取次數(shù)考察結(jié)果

2.4 正交實(shí)驗(yàn)

通過前期的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了料液比、回流提取時(shí)間、提取溶劑的pH值、提取次數(shù)、提取的溫度，結(jié)果顯示提取次數(shù)對(duì)多糖提取率無顯著影響，故確定提取次數(shù)為1次。浸提工藝以料液比、回流提取時(shí)間、提取溶劑的pH值、浸提溫度為因變量，設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)四因素三水平實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)和結(jié)果見表1、表2。

表1 正交設(shè)計(jì)因素與水平

表2 正交設(shè)計(jì)因素與水平

表3 方差分析

由表2、3可知，提取溫度對(duì)紅藍(lán)草多糖的提取結(jié)果影響最大，料液比次之，提取時(shí)間影響較?。黄渥罴训奶崛l件為A3B2C2D3，即料液比為1:40（m:V），提取溫度100℃，提取時(shí)間為120min，提取溶劑pH值4.5，提取次數(shù)1次。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在最佳工藝條件下，取藥材粗粉約1.0g，試精密稱定6份，進(jìn)行6次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，取0.3mL供試品溶液，照“2.2.4”的方法，自“加水補(bǔ)足至2mL”起，依次顯色，分別測(cè)定其吸光度值，其含量分別為8.2349%、8.1384%、8.2543%、8.1724%、7.9103%、8.3634%，平均提取率為8.018%，多糖含量的RSD為1.87%。說明該工藝穩(wěn)定

2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取取已知多糖含量（以驗(yàn)證試驗(yàn)平均值計(jì)算）的藥材粗粉6份，每份約0.05g，精密稱定，精密加入適量對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，取0.3mL供試品溶液，照“2.2.4”的方法，自“加水補(bǔ)足至2mL”起，依次顯色，分別測(cè)定其吸光度值，計(jì)算多糖含量。由表4可知，回收率為94.78%，說明紅藍(lán)草多糖測(cè)定方法可行。

表4 紅藍(lán)草多糖加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3 討論

本文以多糖提取率為考察指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了紅藍(lán)草多糖熱水浸提工藝。最終確定紅藍(lán)草多糖的最佳提取工藝為：料液比為1:40（m:V），提取溫度100℃，提取時(shí)間為120min，提取溶劑pH值4.5。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取溶劑pH值4.5對(duì)多糖提取率有不同程度的影響，其中提取溫度、料液比影響最顯著，各因素間存在不同程度的交互作用。該方法比較直觀、方便，實(shí)驗(yàn)精度高，同時(shí)也說明紅藍(lán)草除了主成分紫藍(lán)素類、黃酮類外，其多糖的含量也較高，為紅藍(lán)草的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

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當(dāng)前，“雙師型”教師是學(xué)校較為缺乏一種類型，因此學(xué)校要重視對(duì)教師的培養(yǎng)。在技能比賽中，筆者會(huì)發(fā)現(xiàn)：有的教師自身的實(shí)踐操作水平較高，但是其自身的理論水平較低；有的教師自身的實(shí)踐操作水平、理論水平卻都比較低。所以學(xué)校要重視教師的培訓(xùn)，在培訓(xùn)中來提升教師的專業(yè)水平。

學(xué)校在培養(yǎng)“雙師型”教師隊(duì)伍的時(shí)候要采取以下的措施：第一，安排老師到企業(yè)鍛煉，不斷提高老師的專業(yè)水平。第二，學(xué)校要安排專門的時(shí)間讓教師參加專業(yè)培訓(xùn)班，在培訓(xùn)之后要考核老師，只有考核通過的教師才可以繼續(xù)任職。第三，從企業(yè)聘請(qǐng)有經(jīng)驗(yàn)的員工來?yè)?dān)任該專業(yè)的老師，從而可以將一些實(shí)際操作中遇到的問題告訴學(xué)生。第四，構(gòu)建科學(xué)的獎(jiǎng)懲機(jī)制，及時(shí)表?yè)P(yáng)在工作中表現(xiàn)突出的教師。

（4）借助技能大賽來提高畢業(yè)生的就業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力

技能大賽的目的在于引導(dǎo)學(xué)校重視技能訓(xùn)練，促使學(xué)生的技能水平得以提高。在大賽中，學(xué)生可以將自身的才能展現(xiàn)出來，并且企業(yè)也可以了解到學(xué)生，從而便于企業(yè)選拔人才。在比賽時(shí)，學(xué)校要邀請(qǐng)企業(yè)來當(dāng)評(píng)委，并且要召開現(xiàn)場(chǎng)招聘會(huì)，這樣做既為學(xué)生提供了就業(yè)機(jī)會(huì)，又便于企業(yè)從中選取更多優(yōu)秀的人才。在平時(shí)的課程設(shè)置中，學(xué)校要充分考慮到企業(yè)的實(shí)際需求，從而提高畢業(yè)生的就業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力。

3 結(jié)束語(yǔ)

建筑工程類技能大賽不僅推動(dòng)著學(xué)校課程體系的改革，還推動(dòng)著學(xué)校教學(xué)方式的改革。與此同時(shí)技能大賽這一模式具有明顯的操作性，因此在參賽過程中學(xué)生的實(shí)踐操作能力得到了明顯的提高。

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Optimize Extraction Process of Polysaccharide in Peristrophe roxburghiana(Schult.)Bremk.

To optimize the extraction process of polysaccharide in Peristrophe roxburghiana. Sulfuric acid - phenol method is used to determine the content of polysaccharide in Peristrophe roxburghiana. The influence of solid- liquid ratio、temperature、 time and extraction solution pH on extraction yield of the polysaccharide in Peristrophe roxburghiana were discussed with orthogonal test method. The impact sequence of the factors on the extraction rate of polysaccharide in Peristrophe roxburghiana was as follows: temperature＞solid-liquid ratio＞extraction solution pH＞time; The optimal extraction condition was extraction temperature of 100℃、solid- liquid ratio of 1:40、extraction time of 2h and extracted solution pH=4.5. Under these optimal conditions,the extracting rates of polysaccharide in Peristrophe roxburghiana is 8.018%.The content of polysaccharide is high which can be exploited and utilized as another new ingredient.

Peristrophe roxburghiana ; polysaccharides; extraction process

R284.2

A

1008-1151(2015)03-0068-03

2015-02-11

廣西教育廳高校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(KY2015YB265);校級(jí)課題(2014QN-N001)。

韋正（1986－），男，河池學(xué)院助教，從事民族藥品質(zhì)與藥效相關(guān)性研究、藥物分析、中藥化學(xué)成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究。