血管平滑肌細胞傳代培養(yǎng)對內(nèi)皮祖細胞吞噬Ac-LDL能力的影響及意義

朱光旭,周芳,朱向情,楊建勇,阮光萍，龐榮清，黃嵐,康華莉,潘興華

·干細胞與再生醫(yī)學(xué)·

血管平滑肌細胞傳代培養(yǎng)對內(nèi)皮祖細胞吞噬Ac-LDL能力的影響及意義

朱光旭,周芳,朱向情,楊建勇,阮光萍，龐榮清，黃嵐,康華莉,潘興華

目的建立細胞共培養(yǎng)體系，探討共培養(yǎng)的傳代血管平滑肌細胞（SMCs）對內(nèi)皮祖細胞(EPCs)吞噬Ac-低密度脂蛋白（Ac-LDL）能力的影響及意義。方法應(yīng)用含15%FBS、細胞生長因子100μg/m l的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)EPCs，組織塊法培養(yǎng)SMCs，分別應(yīng)用Dil標記乙?；兔芏戎鞍?Dil-Ac-LDL)與FITC標記荊豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-Ⅰ)熒光雙染以及α-SM-actin免疫熒光，對EPCs和SMCs進行鑒定。以單純EPCs作為對照，分別將第1、4、8及第16代SMCs與EPCs進行非接觸或混合共培養(yǎng)，熒光顯微鏡觀察EPCs吞噬Dil-Ac-LDL能力，激光共聚焦顯微鏡拍照并使用ImageJ1.48u圖像分析軟件進行細胞熒光強度分析。結(jié)果在非接觸性共培養(yǎng)系統(tǒng)，與對照相比，第1、4、8代SMCs對EPCs吞噬Ac-LDL無明顯影響，但是第16代SMCs卻顯著抑制其吞噬能力；在混合共培養(yǎng)系統(tǒng)，第1、16代SMCs均顯著抑制EPCs吞噬Ac-LDL（分別為P＜0.05與P＜0.01）。結(jié)論EPCs吞噬Ac-LDL受SMCs傳代培養(yǎng)以及接觸方式的影響，合成型SMCs顯著抑制EPCs吞噬Ac-LDL，提示應(yīng)用EPCs移植治療損傷血管可能存在“時機窗”，血管損傷后極早或過晚應(yīng)用EPCs移植均可能達不到修復(fù)血管損傷的最佳治療效果。

內(nèi)皮祖細胞；血管平滑肌細胞；Ac-LDL；內(nèi)皮細胞

內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是可以分化為血管內(nèi)皮細胞（endothelial cells,ECs）的前體細胞，該類細胞既表達CD31、KDR等成熟ECs標志，同時具有干、祖細胞特性[1]。ECs吞噬Ac-低密度脂蛋白（Ac-LDL）是其重要生物學(xué)功能之一，其吞噬能力變化一定程度反映了其內(nèi)皮特性或功能改變。EPCs具備類似生物學(xué)特性，既往研究常以吞噬Dil標記乙?；兔芏戎鞍?Dil-labeled acetylated low density lipoprotein,Dil-Ac-LDL)能力作為鑒定EPCs的一個重要指標[2]。細胞間相互作用是細胞生命活動的一種重要調(diào)節(jié)方式[3]。EPCs移植歸巢到血管損傷部位后，細胞間影響主要來自血管損傷邊緣ECs、再生內(nèi)皮或損傷處局部暴露的SMCs，推測EPCs與血管損傷處SMCs間相互作用也可能影響損傷血管修復(fù)進程。血管SMCs可分為收縮型(分化型)和合成型(未分化型或去分化型)兩種表型，正常血管SMCs為收縮型，血管損傷后暴露的SMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致增生、遷移和新生內(nèi)膜形成。本實驗擬通過細胞混合共培養(yǎng)及采用Transwell共培養(yǎng)板進行非接觸性共培養(yǎng)，初步探討培養(yǎng)不同代SMCs以及與SMCs不同接觸培養(yǎng)方式對EPCs吞噬Ac-LDL能力的影響，為臨床應(yīng)用EPCs移植治療血管性疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料SD大鼠(1~2月齡，雌雄不限)由第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院實驗動物中心提供。DMEM/ F12干粉培養(yǎng)基（Hyclone），內(nèi)皮細胞生長添加劑（ECGS，BD公司），優(yōu)質(zhì)胎牛血清（PAA公司）,Dil標記乙?；兔芏戎鞍?DiL-Ac-LDL，Molecular Probe)，F(xiàn)ITC標記荊豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-Ⅰ，Vector)，F(xiàn)icoll液(Amersham)，大鼠血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF,Sigma），F(xiàn)icoll液(Histo-paque 21083，Sigma)，抗大鼠α-SMA及DAPI（Sigma），F(xiàn)ITC-CD31 (Antigenix)，倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡以及激光共聚焦顯微鏡(Leica公司)，CO2細胞培養(yǎng)箱（Harris公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)及鑒定EPCs培養(yǎng)參照文獻[4]，脫臼處死SD大鼠，無菌取出股骨和脛骨，PBS沖洗骨髓，F(xiàn)icoll液密度梯度離心(2000 r/min,30 min)分離骨髓單個核細胞(mononuclear cells，MNCs)，PBS洗滌后，差速貼壁法培養(yǎng)并進行表型鑒定，以含20%FBS和雙抗的DMEM/F12采用組織塊法培養(yǎng)SMCs[5]，每隔3 d換液1次，應(yīng)用α-SM-actin抗體進行SMCs表型鑒定。

1.3 實驗分組實驗共分5組：（1）對照組（Con）：以單純培養(yǎng)的EPCs作為對照；（2）P1組：以第1代培養(yǎng)SMCs與EPCs共培養(yǎng)；（3）P4：以第4代培養(yǎng)SMCs與EPCs共培養(yǎng)；（4）P8：以第8代培養(yǎng)SMCs與EPCs共培養(yǎng)；（5）P16：EPCs第16代培養(yǎng)SMCs與EPCs共培養(yǎng)。

1.4 非接觸共培養(yǎng)使用含20%FBSDMEM/F12培養(yǎng)基，于6孔板，以1×104/ml、3 ml/孔等量接種不同代SMCs，待SMC長至鋪滿孔底約50%~60%時，換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；以10%FBSDMEM/ F12培養(yǎng)基（含ECGs 100μg/ml，肝素100μg/ml，青霉素、鏈霉素各100 U/ml）1×104個/ml、3ml/膜，差速貼壁法等量接種骨髓單個核細胞于Transwell insert膜(膜孔徑0.4μm)上，24 h后棄未貼壁細胞，然后將Transwell insert插入種有SMCs的6孔板中，使下室為SMCs，上室為EPCs，換上含10μg/ml的Dil-Ac-LDL、10%FBS DMEM/F12培養(yǎng)基（含ECGs 100μg/ml，肝素100μg/ml，青霉素、鏈霉素各100 U/ml），5 m l/孔進行培養(yǎng)，兩室培養(yǎng)基通過Transwell insert膜交通，建立Transwell共培養(yǎng)體系。24 h后熒光顯微鏡觀察，采用激光共聚焦顯微鏡拍照后，應(yīng)用ImageJ1.48u圖像分析軟件（National Institutes of Health，USA）進行細胞熒光強度分析，通過軟件轉(zhuǎn)換，以獲得光密度代表熒光強度，普通光鏡下計數(shù)同一視野下EPCs數(shù)，細胞平均光密度=總光密度/細胞數(shù)。

1.5 混合共培養(yǎng)使用96孔板，取骨髓單個核細胞制備成5×106個/ml細胞懸液，以200μl/孔、速貼壁法接種。細胞貼壁后，換含50μg/ml DAPI、10% FBSDMEM/F12培養(yǎng)基（含內(nèi)皮細胞生長因子添加劑100μg/ml，肝素100μg/ml，青霉素、鏈霉素各100 U/ml）標記12 h，PBS洗滌細胞7次，然后以含10μg/ml的Dil-Ac-LDL、10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基（含內(nèi)皮細胞生長添加劑100μg/ml，肝素100 μg/ml，青霉素、鏈霉素各100 U/ml）制備濃度為3× 104個/ml SMCs細胞懸液，以200μl/孔接種于培養(yǎng)有EPCs的孔內(nèi)，24 h后熒光顯微鏡觀察、拍照，同法獲取細胞平均光密度。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)細胞生長特征及鑒定與我們前期實驗結(jié)果類似[6]，經(jīng)2次貼壁培養(yǎng)的骨髓EPCs大多呈梭形或卵圓形，2次貼壁后第3 d可見明顯索狀生長結(jié)構(gòu)（圖1A）；EPCs培養(yǎng)第14 d細胞逐漸呈融合生長狀態(tài)（圖1B），Dil-Ac-LDL（圖1C）及FITC-UEA-Ⅰ（圖1D）雙熒光染色顯示培養(yǎng)細胞具有EPCs特性，熒光雙染陽性率為（95.6±8.3）%。培養(yǎng)5 d左右可見長梭型細胞自組織塊邊緣長出，14 d左右可見培養(yǎng)細胞呈“谷峰”樣生長（圖1E），取傳代培養(yǎng)細胞進行α-SM-actin染色呈陽性（圖1F），證實所培養(yǎng)的細胞為血管SMCs。

圖1 培養(yǎng)骨髓EPCs及血管SMCs生長特征

2.2 非接觸共培養(yǎng)SMCs對EPC吞噬Dil-Ac-LDL能力的影響與對照組（207.87±61.82）相比，P1、P4、P8組共培養(yǎng)EPCs吞噬Ac-LDL能力（平均光密度分別為193.7±49.37、203.45±22.54、203.95±34.06）均無顯著差別，但是P16組吞噬能力（130.27±32.79）與對照組相比顯著下降（n=4，P＜0.05）。見圖2。

圖2 非接觸共培養(yǎng)SMCs對EPCs吞噬Dil-Ac-LDL能力的影響

2.3 混合共培養(yǎng)SMCs對EPCs吞噬Dil-Ac-LDL能力的影響實驗結(jié)果顯示，與對照組（206.44± 48.64）相比，P1組（182.15±40.63）和P16組（130.27± 32.79）共培養(yǎng)EPCs吞噬Dil-Ac-LDL能力顯著降低（n=4，分別為P＜0.05與P＜0.01），P4組（200.24± 12.16）和P8組（193.95±20.06）吞噬能力與對照組比較未見顯著差別。

圖3 混合共培養(yǎng)SMCs對EPCs吞噬Ac-LDL能力的影響

3 討論

細胞間調(diào)節(jié)是細胞生命活動的重要方式之一。既往研究表明，細胞間接觸方式影響到細胞間調(diào)節(jié)效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，與ECs非接觸共同培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）表達豐富排列有序的SMCsα-actin，當與ECs混合共培養(yǎng)時α-actin蛋白表達增強，然而肌絲排列紊亂；MSCs與SMCs混合共同培養(yǎng)時，則表達SMCs鈣結(jié)合蛋白（calponin）和SMCsα-actin；當間接共培養(yǎng)時，MSCs未見SMCsα-actin表達[7]。本研究結(jié)果顯示，在非接觸共培養(yǎng)體系中，第1、4以及第8代SMCs對EPCs吞噬Ac-LDL能力均無顯著影響，但使用第16代SMCs進行共培養(yǎng)，EPCs吞噬能力顯著降低。在混合共培養(yǎng)體系中，第1代和第16代SMCs均使EPCs吞噬能力顯著降低，提示接觸方式不同和SMCs傳代不同均可以影響到EPCs內(nèi)皮分化特性和功能。EPCs吞噬Ac-LDL能力部分反映其可以誘導(dǎo)分化為成熟ECs的能力。肌蛋白切割蛋白（myoseverin）可阻抑EPCs分化表達KDR、CD31及vWF，抑制EPCs分化形成管形，同時也觀察到EPCs對Ac-LDL吞噬能力減弱[8]；高糖血癥可抑制EPCs分化為成熟ECs，同時也觀察到EPCs吞噬Ac-LDL能力降低[9]。傳代SMCs可以抑制EPCs吞噬Ac-LDL能力，可能部分代表EPCs內(nèi)皮功能和內(nèi)皮分化潛能的改變。

SMCs本身具有比較復(fù)雜的生物學(xué)特性，正常血管SMCs為收縮型，血管損傷后SMCs由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致SMCs增生、遷移。體外培養(yǎng)SMCs在第10代以前、第10~200代以及第200代以后，分別保持收縮型、合成型和轉(zhuǎn)化表型[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，SMCs由于傳代培養(yǎng)可以導(dǎo)致共培養(yǎng)的EPCs吞噬Ac-LDL能力不同，可能是由于傳代培養(yǎng)導(dǎo)致SMCs表型改變，引起不同的調(diào)節(jié)效應(yīng)。實驗觀察到無論是接觸或混合培養(yǎng)，第16代SMCs均顯著抑制EPCs吞噬Ac-LDL，但是實驗結(jié)果顯示，混合共培養(yǎng)組第1代SMCs也顯著抑制了EPCs吞噬Ac-LDL能力。這種由于接觸方式不同而導(dǎo)致吞噬能力產(chǎn)生的差異，其中原因值得今后深入探究。

基于目前獲得的實驗結(jié)果認為，EPCs移植時治療損傷血管可能存在最佳“時機窗”，即：血管損傷后即刻或者過晚應(yīng)用EPCs移植可能達不到修復(fù)損傷內(nèi)膜的最佳治療效果，EPCs歸巢到內(nèi)膜損傷部位后的內(nèi)皮分化能力，可能與血管損傷處局部暴露的SMCs表型相關(guān)聯(lián)，收縮型極早期以及不可逆性合成狀態(tài)或轉(zhuǎn)化狀態(tài)SMCs均可能不利于促進EPCs向ECs分化修復(fù)損傷血管內(nèi)膜；共培養(yǎng)SMCs對EPCs吞噬Ac-LDL能力的不同影響，也間接提示血管損傷后損傷局部暴露的SMCs表型不同，與損傷局部再生內(nèi)皮的表型改變和功能障礙可能有一定內(nèi)在聯(lián)系。

本研究證實，不同代的培養(yǎng)SMCs影響EPCs吞噬Ac-LDL能力，可能調(diào)節(jié)EPCs的內(nèi)皮分化特性或功能。但是詳細調(diào)節(jié)機制尚需更多實驗加以闡明，同時也需進一步的在體研究加以驗證。

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Effects of vascular smooth muscle cells subculturing on Ac-LDL phagocytosis ability of endothelial progenitor cells and its significance

Zhu Guangxu1,Zhou Fang1,Zhu Xiangqing1,Yang Jianyong1,Ruan Guangping1,Pang Rongqing1,Huang Lan2,Kang Huali2,Pan Xinghua11.Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command/Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province/Key Laboratory of Cell Therapeutic Transforming Medicine of Yunnan Province/Kunming Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine,Kunming,Yunnan,650032,China;2.The Institute of Cardiovascular Disease Research of PLA,Xinqiao Hospital of the Third Military Medical University,Chongqing,430003,China

Objective To establish the cellular co-culture system,and to investigate the effects of vascular smoothmuscle cells (SMCs)subculturing on Ac-LDL phagocytosis ability of endothelial progenitor cells(EPCs)and its significance.Methods EPCs were cultured through DMEM/F 12 culturemedium containing 15%fetal bovine serum and 100μg/ml endothelial cell growth supplements (ECGs).SMCs were cultured by tissue block method.Dil-labeled acetylated low density lipoprotein and FITC-labeled ulex europaeus agglutinin 1(FITC-UEA-1)fluorescent double staining andα-SM-actin immunofluorescence were used to identify EPCs and SMCs.Pure EPCswere used as the control,and the passage(P)1,4,8,and 16 SMCswere co-cultured with EPCs in a non-contact ormixing way.Fluorescencemicroscope was used to observe the Dil-Ac-LDL phagocytosis ability of EPCs,and laser confocalmicroscopy was used to take photographs.Cellular fluorescence intensity was analyzed by ImageJ1.48u image analysis software.Results Compared with the control,in the non-contact co-culture system,P1,4,and 8 SMCs had no significant effect on Ac-LDL phagocytosis of EPCs.However,P16 SMCsmarkedly attenuated this Ac-LDL phagocytosis ability of EPCs.In themixing co-culture system,both P1 and 16 SMCs significantly inhibited the Ac-LDL phagocytosis ability of EPCs(P＜0.05,and P＜0.01).Conclusion The Ac-LDL phagocytosis ability of EPCs is affected by SMCs subculturing and exposure chamber.Synthetic SMCsmay significantly inhibit the EPCs'Ac-LDL phagocytosis ability,which indicates that there may be an"opportunity window"suitable for EPCs transplant treatment on injured blood vessel,and the application of EPCs transplantation too early or too late after the vascular injury may not achieve the best curative effecton the recovery of vascular injury.

endothelial progenitor cell;smoothmuscle cell;Ac-LDL;endothelial cell

R 318.1

A

1004-0188（2015）08-0813-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2015.08.001

2015-03-26）

國家自然科學(xué)基金（81170316，81101158）；“973”基礎(chǔ)研究規(guī)劃項目（2012CB518100）；云南省科技計劃項目(2011HB050,2013DA004）；成都軍區(qū)基金項目（2012WJ003）

650032昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細胞生物治療中心、云南省干細胞工程實驗室、云南省細胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室、昆明市干細胞與再生醫(yī)學(xué)重點實驗室（朱光旭,周芳,朱向情,楊建勇,阮光萍，龐榮清，潘興華）；第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院全軍心血管疾病研究所（黃嵐,康華莉）

龐榮清,E-mail：pangrq2000@aliyun.com；潘興華,E-mail：xinghuapang@aliyun.com