高效液相色譜－紫外檢測法同時測定食品接觸材料中7種苯多酸及其衍生物的特定總遷移量

王建玲， 肖曉峰， 陳 彤， 劉艇飛， 何 軍， 鄧弘毅， 楊娟娟

（臺州出入境檢驗檢疫局，浙江 臺州318000）

苯多酸中的對苯二甲酸屬于低毒類化合物，與鄰苯二甲酸、間苯二甲酸和偏苯三甲酸等苯多酸類似，對眼睛、皮膚、黏膜和上呼吸道有刺激作用。苯多酸可作為單體或功能助劑，廣泛應(yīng)用于聚酯樹脂、不飽和聚酯樹脂等塑料的生產(chǎn)中［1，2］。一些食品接觸材料制品中殘留或降解出來的苯多酸［3，4］在使用過程中會遷移到食物中，直接危害人體健康。歐盟在2011年發(fā)布的（EU）No 10／2011 法規(guī)［5］將 7 種苯多酸及其衍生物的特定總遷移量（total specific migration limit，SML（T））限定為 5 ～7.5 mg／kg（見表1）。

表1 苯多酸及其衍生物的名稱、縮寫、CAS號、相對分子質(zhì)量和特定總遷移量限值Table 1 Chemical names，abbreviations，CAS Nos.，relative molecular masses and total specific migration limits（SML（T））for benzene polycarbonic acids and their derivatives

目前，國內(nèi)外有關(guān)苯多酸的檢測主要集中在塑料［3］、化學(xué)試劑［6］、空氣［7］、雪［8］、尿液［9］以及食品模擬物［10-12］等樣品中。主要使用的檢測方法有氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）［3］、氣相色譜法（GC）［8］和高效液相色譜法（HPLC）［6，7，10-13］。已有的檢測標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)［10-12］僅能檢測食品模擬物中對苯二甲酸的遷移量，無法對歐盟（EU）No 10／2011法規(guī)中苯多酸的特定總遷移量進(jìn)行檢測。

本研究旨在建立采用高效液相色譜-紫外檢測（HPLC-UV）同時測定食品模擬物（10% （v／v）乙醇、20% （v／v）乙醇、50% （v／v）乙醇、3% （w／v）乙酸和橄欖油）中偏苯三甲酸、偏苯三甲酸酐、間苯二甲酰氯、間苯二甲酸、對苯二甲酰氯、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸的特定總遷移量（SML（T））的方法。考慮到偏苯三甲酸酐、間苯二甲酰氯、對苯二甲酰氯的化學(xué)性質(zhì)活潑，極易與水反應(yīng)生成對應(yīng)的苯多酸，參考國內(nèi)外類似標(biāo)準(zhǔn)［14，15］，這3種物質(zhì)相關(guān)的特定總遷移量只需檢測其對應(yīng)的苯多酸。該方法色譜分離和線性關(guān)系較好，回收率和準(zhǔn)確度高，完全滿足歐盟（EU）No 10／2011法規(guī)附表2中7種苯多酸及其衍生物的SML（T）的限量要求。并已成功應(yīng)用于食品接觸材料相關(guān)制品中苯多酸及其衍生物的特定遷移量的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

Agilent 1290高效液相色譜儀及二極管陣列檢測器（安捷倫公司）；Synergi Polar-RP色譜柱（250 mm×4.6 mm，4 μm，美國菲羅門公司）；MMV-1000W分液漏斗振蕩器（日本EYELA公司）；Milli-Q Gradient純水儀（Millipore公司）；親水性聚四氟乙烯、尼龍、聚醚砜針頭過濾器均購于杭州格陵科學(xué)儀器有限公司；鄰苯二甲酸、間苯二甲酸、對苯二甲酸和偏苯三甲酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%，見表1）購于百靈威公司；甲醇、異丙醇為色譜純（Merck公司）；其他試劑均為分析純。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間儲備液的配制：分別準(zhǔn)確稱取25.0 mg鄰苯二甲酸、間苯二甲酸、對苯二甲酸和偏苯三甲酸標(biāo)準(zhǔn)品于150 mL燒杯中，加入50 mL異丙醇，水浴加熱至60℃使其充分溶解，待溶液冷卻后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用異丙醇定容，配成250 mg／L的4種苯多酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別精密吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液 0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、4.8 mL至6個10 mL容量瓶中，用異丙醇定容得質(zhì)量濃度分別為5.00、10.0、20.0、40.0、80.0、120 mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間儲備液。

水基食品模擬物標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別移取1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間儲備液至6個10 mL容量瓶中，用食品模擬物（10% （v／v）乙醇、20% （v／v）乙醇、50% （v／v）乙醇或3% （w／v）乙酸水溶液）定容至刻度，混勻。橄欖油食品模擬物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備：分別稱取橄欖油模擬物10 g（精確至0.1 g），置于6個50 mL具塞塑料離心試管中，分別加入10 mL正庚烷和1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間儲備液，混勻后再加入4.00 mL 0.1% （w／v）乙酸銨水溶液，旋緊塞子，300 r／min下振蕩20 min，再靜置15 min，用2 mL注射器吸取下層水溶液約2 mL，過0.45 μm聚四氟乙烯針頭過濾器至預(yù)先裝有5 μL磷酸的2 mL樣瓶中，蓋緊蓋子，渦旋混勻。

1.2 遷移試驗

根據(jù)待測樣品的預(yù)期用途及使用條件，參照歐洲標(biāo)準(zhǔn)［16］和（EU）No 10／2011 法規(guī)選擇合適的遷移試驗條件。分別用 10% （v／v）的乙醇（A）、3%（w／v）乙酸（B）、20% （v／v）乙醇（C）、50% （v／v）乙醇（D1）和橄欖油（D2）浸泡樣品。對可能較長時間與食品高溫接觸的尼龍鏟樣品，在100℃浸泡2 h；其他室溫下與食品長時間接觸的聚乙烯塑料袋、聚乙烯保鮮膜、聚丙烯盒、聚對苯二甲酸乙二醇瓶、聚對苯二甲酸乙二醇盒等樣品，在40℃浸泡10天。

1.3 樣品前處理

用食品模擬物浸泡待測樣品，冷卻至室溫并混勻。水基食品模擬物：用注射器取水基食品模擬物1～2 mL，經(jīng)親水性聚四氟乙酸針頭過濾器過濾至進(jìn)樣瓶中，待測。橄欖油食品模擬物：稱取橄欖油模擬物10 g（精確至0.1 g）于50 mL具塞塑料離心試管中，分別加入10.0 mL正庚烷和1.00 mL異丙醇，混勻后再加入4.00 mL 0.1%（w／v）乙酸銨水溶液，旋緊塞子，置于分液漏斗振蕩器上300 r／min下振蕩20 min，再靜置15 min，用2 mL注射器吸取下層水溶液約2 mL，過0.45 μm 聚四氟乙烯針頭過濾器至預(yù)先裝有5 μL磷酸的樣品瓶中，蓋緊蓋子，混勻后上樣。

1.4 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Synergi Polar-RP柱（250 mm ×4.6 mm，4 μm）。流動相 A 為 20 mmol／L磷酸二氫鉀水溶液，用磷酸調(diào)pH至3.4，過0.22 μm濾膜待用；流動相B為體積比1∶1的異丙醇-甲醇溶液。梯度洗脫程序：0～0.5 min，2%B；0.5～28 min，2%B～32%B；28～29 min，32%B；29.0～29.5 min，32%B ～2%B；柱后運(yùn)行 4 min。柱溫箱溫度 40℃；進(jìn)樣量 10 μL；流速 1 mL／min；檢測波長232 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 偏苯三甲酸酐、間苯二甲酰氯、對苯二甲酰氯的處理

（EU）No 10／2011 法規(guī)［5］附表2 對7 種苯多酸及其衍生物的特定總遷移量進(jìn)行了限定，除BTCA、TPA、PA、IPA 4種苯多酸外，還包括一種水解活性很強(qiáng)的酸酐（偏苯三甲酸酐）和兩種比酸酐類水解活性更強(qiáng)的酰氯類物質(zhì)（間苯二甲酰氯、對苯二甲酰氯）。由于水基食品模擬物中主要成分是水，遷移到水基食品模擬物中的偏苯三甲酸酐、間苯二甲酰氯、對苯二甲酰氯會立即水解成對應(yīng)的偏苯三甲酸、間苯二甲酸和對苯二甲酸；遷移到油性食品模擬物中的偏苯三甲酸酐、間苯二甲酰氯、對苯二甲酰氯也可以添加水溶液，使它們也水解成對應(yīng)的偏苯三甲酸、間苯二甲酸和對苯二甲酸，并提取出來。故7種苯多酸及其衍生物特定總遷移量的檢測只需要檢測對應(yīng)的4種苯多酸。已有的標(biāo)準(zhǔn)［14，15］也使用了相同的處理方法，比如食品模擬物中順丁烯二酸和順丁烯二酸酐的檢測，只需檢測順丁烯二酸［14］。

2.2 色譜分離條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

考察了 C8、C18和 Polar-RP柱對 BTCA、PA、TPA和IPA的色譜分離情況。3種色譜柱以20 mmol／L磷酸二氫鉀-磷酸水溶液（pH 3.4）和甲醇為流動相，在甲醇比例為40%的條件下等度洗脫苯多酸的色譜圖見圖1。C8柱分離這4種苯多酸時，PA、TPA和IPA都存在一定的拖尾，其中TPA拖尾較為嚴(yán)重；C18柱分離這4種苯多酸時，4種苯多酸都存在較嚴(yán)重的拖尾；而使用Polar-RP柱能夠?qū)崿F(xiàn)這4種苯多酸的基線分離，且峰形對稱，故后續(xù)試驗采用Polar-RP柱進(jìn)行試驗。

圖1 C8柱、C18柱和Polar－RP柱對4種苯多酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（60 mg／L）的分離色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution of the fourbenzenepolycarbonicacids（60 mg／L）on C8，C18and Polar－RP column

2.2.2 流動相緩沖鹽濃度的優(yōu)化

考察了 5、10、20、50 mmol／L 的磷酸二氫鉀-磷酸水溶液（pH 3.4）-甲醇（60∶40，v／v）流動相對BTCA、PA、TPA和IPA色譜分離的影響，Polar-RP柱上分離BTCA、PA、TPA和IPA的色譜圖見圖2。結(jié)果表明，磷酸二氫鉀為5或10 mmol／L時，TPA和IPA都存在伸舌現(xiàn)象，磷酸二氫鉀濃度升至20或50 mmol／L時，4種苯多酸峰的峰形都變成了標(biāo)準(zhǔn)的高斯峰。另考察了0.05%（w／v）甲酸、0.05%（w／v）乙酸、0.1% （w／v）甲酸、0.1% （w／v）乙酸水溶液對4種苯多酸的分離情況，使用這4種揮發(fā)性酸流動相代替20 mmol／L磷酸二氫鉀-磷酸水溶液，會導(dǎo)致BTCA峰較嚴(yán)重的拖尾?？紤]到過高的緩沖鹽濃度可能會對色譜柱不利，故后續(xù)試驗選用20 mmol／L磷酸二氫鉀-磷酸水溶液作流動相對BTCA、PA、TPA和IPA進(jìn)行色譜分離。

圖2 不同流動相添加劑濃度對4種苯多酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（60 mg／L）色譜分離的影響Fig.2 Effect of the concentration of mobile phase additives on the chromatographic separation of mixed standard solution of the four benzene polycarbonic acids （60 mg／L）

2.2.3 流動相緩沖鹽pH的優(yōu)化

考察了 pH 值分別為 5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5的20 mmol／L磷酸二氫鉀-磷酸水溶液流動相對BTCA、PA、TPA和IPA色譜分離的影響。Polar-RP柱在甲醇比例為40%時等度洗脫BTCA、PA、TPA和IPA的色譜圖見圖3。磷酸二氫鉀-磷酸水溶液的pH為5.0時，BTCA、PA和TPA的峰未完全分開；pH降至4.5時，TPA峰發(fā)生了嚴(yán)重變形；pH降至4.0時，PA和和IPA的色譜峰伸舌嚴(yán)重；pH降至3.5、3.0或2.5時，4種苯多酸達(dá)到了基線分離，且峰形都變成了標(biāo)準(zhǔn)的高斯峰。由于過低的pH（pH＜2）將接近或超出色譜柱的pH使用范圍，故磷酸二氫鉀-磷酸水溶液流動相較合適的pH范圍為2.5～3.5。

圖3 流動相pH對4種苯多酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（60 mg／L）色譜分離的影響Fig.3 Effect of the mobile phase pH on the chromatographic separation of mixed standard solution of the four benzene polycarbonic acids（60 mg／L）

2.2.4 等度洗脫和梯度洗脫的選擇

在優(yōu)化完色譜柱、流動相緩沖鹽的類型、濃度及pH值之后，對于水基食品模擬物，在等度洗脫條件下就能獲得滿意的色譜分離效果。但在進(jìn)行橄欖油食品模擬物提取液的色譜分離時，發(fā)現(xiàn)等度洗脫時PA與后面的3個干擾峰部分重疊在一起，TPA與前面的干擾峰也難以分開（見圖4），特別是在PA和TPA濃度較低時，將會嚴(yán)重影響TPA和PA的準(zhǔn)確定量。為了消除橄欖油中的干擾雜質(zhì)峰對PA和TPA定量的影響，優(yōu)化了梯度洗脫程序，能夠?qū)⒖瞻组蠙煊吞崛∫褐械母蓴_雜質(zhì)同4種苯多酸完全分離。在優(yōu)化好的HPLC-UV儀器條件下，8 mg／kg的4種苯多酸在5種食品模擬物中的分離色譜圖如圖5所示，BTCA、PA、TPA和IPA 4種苯多酸均達(dá)到了基線分離，并消除了橄欖油食品模擬物中等度洗脫時的干擾峰。

圖4 （a）空白橄欖油提取液和（b）4種苯多酸橄欖油提取液（0.2 mg／kg）的色譜圖Fig.4 Chromatograms of（a）olive oil blank sample and（b）olive oil sample with the four benzene polycarbonic acids （0.2 mg／kg）

2.3 樣品前處理

2.3.1 濾膜的選擇

水基食品模擬物用過針式過濾器過濾后直接進(jìn)樣分析，操作簡便，避免了未經(jīng)任何處理直接進(jìn)樣容易導(dǎo)致的儀器系統(tǒng)堵塞故障。考察了3類常用的水系針頭過濾器（尼龍針頭、聚醚砜針頭、聚四氟乙烯針頭）對4種苯多酸回收率的影響。在水基食品模擬物中，分別添加4種苯多酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至2.5 μg／kg，混勻后取每種食品模擬物分別過3種過濾器后直接進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，在過濾這一步，尼龍針頭、聚醚砜針頭、聚四氟乙烯針頭過濾器對3%（w／v）乙酸食品模擬物中4種苯多酸的回收率分別為62.5% ～90.8%、99.1% ～99.9%、99.3% ～99.9%，6次試驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.2%～0.8%、0.04%～0.6%、0.04%～0.45%。聚四氟乙烯針頭過濾器的損失率最小，重復(fù)性也最好，其他水基食品模擬物的試驗結(jié)果相近（數(shù)據(jù)未列出），故后續(xù)試驗均采用親水性聚四氟乙烯針頭過濾器過濾。

圖5 5種食品模擬物中4種苯多酸（8 mg／kg）的色譜圖Fig.5 Chromatograms of the four benzene polycarbonic acids （8 mg／kg）in five food simulants

2.3.2 橄欖油食品模擬物提取試劑的選擇

比較了水、0.1% （w／v）碳酸氫鈉、0.1% （w／v）甲酸銨、0.1% （w／v）磷酸二氫鉀、0.1% （w／v）乙酸銨對橄欖油中4種苯甲酸的提取情況（見圖6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對4種苯多酸的整體提取效果依次為0.1%乙酸銨＞0.1%甲酸銨＞0.1%碳酸氫鈉＞0.1% 磷酸二氫鉀 ＞ 水。標(biāo)準(zhǔn)方法［10，11］所采用的0.1%碳酸氫鈉對橄欖油中的對苯二甲酸的提取效果比較理想，但對BTCA的提取效果很差。整體上，0.1%乙酸銨提取效果最好，故采用0.1%的乙酸銨進(jìn)行橄欖油中4種苯甲酸的提取。

圖6 提取溶劑種類對橄欖油食品模擬物中4種苯多酸（0.4 mg／kg）提取效果的影響Fig.6 Effect of extraction solution type on the extraction of the four benzene polycarbonic acids （0.4 mg／kg）in olive oil food simulants

2.3.3 橄欖油食品模擬物提取時間的選擇

用0.1%（w／v）乙酸銨水溶液提取橄欖油中相同濃度的4種苯多酸，考察了提取時間為5、10、20、30、40、50、60 min時4種苯多酸的色譜峰面積變化情況（見圖7）。發(fā)現(xiàn)提取時間從5 min增加至10 min，以及從10 min增加至20 min時，4種苯多酸的色譜峰面積增加較明顯，但繼續(xù)延長提取時間，4種苯多酸的色譜峰面積變化不大。故適合橄欖油食品模擬物的提取時間為20 min。

圖7 提取時間對橄欖油食品模擬物中4種苯多酸（1.0 mg／kg）提取效果的影響Fig.7 Effect of extraction time on extraction of the four benzene polycarbonic acids （1.0 mg／kg）in olive oil food simulants

2.4 方法的線性關(guān)系及定量限

參照1.1節(jié)中水基食品模擬物標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法，將每種水基食品模擬物配成4種苯多酸質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0 mg／L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；參照1.1節(jié)中橄欖油食品模擬物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備方法，得到橄欖油食品模擬物中4種苯多酸含量分別為 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0 mg／kg的混合工作溶液；從低濃度到高濃度依次進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度或含量（mg／L或 mg／kg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）做校正曲線，計算回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2。在0.5～12 mg／L或mg／kg范圍內(nèi)，4種苯多酸在5種食品模擬物中的響應(yīng)線性關(guān)系良好（r2≥0.999 91），符合定量檢測的要求；以對應(yīng)的食品模擬物稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至信噪比（S／N）=10確定定量限（LOQ），4種苯多酸在5種食品模擬物中的定量限為0.1～0.2 mg／kg，滿足歐盟（EU）No 10／2011 法規(guī)［5］的限量要求（5 ～7.5 mg／kg）。

表2 4種苯多酸的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、線性方程和在食品模擬物中的定量限Table 2 Linear ranges，correlation coefficients （r2），regression equations，limits of quantification of the four benzene polycarbonic acids in food simulants

表2 （續(xù)）Table 2 （Continued）

2.5 回收率和精密度

按照嚴(yán)苛的遷移試驗原則［16］進(jìn)行遷移試驗，取樣品浸泡液加標(biāo)的方式進(jìn)行回收率試驗。每種食品模擬物浸泡液分別添加4種苯多酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至1.25、2.5、6.25 mg／kg，按照 1.3 節(jié)步驟處理分析，加標(biāo)回收率如表3所示，4種苯多酸的加標(biāo)回收率范圍為94.3%～105%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為0.1%～2.3%。影響加標(biāo)回收率的主要因素為HPLC-MS／MS儀器的穩(wěn)定性，以及過針頭過濾器時的損失。

表3 4種苯多酸在5種食品模擬物中的加標(biāo)回收率和精密度（n＝6）Table 3 Spiked recoveries and precisions of the four benzene polycarbonic acids in five food simulants（n＝6）

2.6 實際樣品的檢測

用本方法分別檢測了聚乙烯塑料袋、聚丙烯盒、聚對苯二甲酸乙二醇瓶、聚對苯二甲酸乙二醇盒、尼龍鏟等具代表性的食品接觸材料樣品中苯多酸及其衍生物的遷移量。在聚對苯二甲酸乙二醇瓶的3%（w／v）乙酸食品模擬物中檢出對苯二甲酸和間苯二甲酸，遷移量分別為0.13和0.10 mg／kg，均低于限量要求。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-紫外檢測測定食品接觸材料中偏苯三甲酸、偏苯三甲酸酐、間苯二甲酰氯、間苯二甲酸、對苯二甲酰氯、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸的特定總遷移量的方法。該方法具有樣品處理簡單快速、色譜分離效果和線性相關(guān)性好、回收率和準(zhǔn)確度較高等優(yōu)點，方法的定量限低，能完全滿足歐盟（EU）No 10／2011法規(guī)的限量要求。該方法已應(yīng)用于食品接觸材料相關(guān)制品中苯多酸及其衍生物的特定總遷移量的檢測，并在部分聚對苯二甲酸乙二醇（PET）材質(zhì)的容器中檢出有對苯二甲酸和間苯二甲酸的遷移。本方法可廣泛應(yīng)用于食品接觸材料相關(guān)制品中7種苯多酸及其衍生物特定總遷移量的進(jìn)出口監(jiān)管及產(chǎn)品質(zhì)量控制。

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