雪蓮果葉腐病病原菌鑒定及生物學(xué)特性

涂勇

摘要：從雪蓮果葉片的病斑上分離得到一種病原真菌，根據(jù)病害癥狀特點(diǎn)、病菌形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀等進(jìn)行鑒定，確定其為鏈格孢屬（Alternaria spp.）真菌。設(shè)置不同的培養(yǎng)基、pH值、溫度、濕度及光照對(duì)葉腐病菌進(jìn)行生物學(xué)特性研究，結(jié)果表明，該菌最適生長培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，最佳pH值為7.0，最適生長溫度為 26 ℃，最適生長濕度為65%，光照對(duì)其影響不大。

關(guān)鍵詞：雪蓮果；葉腐??；鏈格孢；鑒定；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)： S432.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0121-03

雪蓮果，屬菊科葵花屬植物，含有酚酸、黃酮、酯類、揮發(fā)油、多糖等成分，清肝解毒、清理腸胃、排毒通便、養(yǎng)顏美容，并有降血糖、降血脂、抑菌、促進(jìn)鐵鈣吸收等藥理作用，特別適合糖尿病人和減肥者食用[1-2]。近年來通過多種途徑進(jìn)入我國，目前已在云南、福建、貴州等地引種栽培成功[3-4]。然而，雪蓮果自傳入我國這十余年來，其相關(guān)理論和技術(shù)研究較少，尤其對(duì)種植過程中病蟲害的發(fā)生情況及其防治措施未見深入研究及報(bào)道，這顯然與近年來其發(fā)展趨勢(shì)是相矛盾的。同時(shí)，近年來由于雪蓮果在四川攀西地區(qū)的大面積連年種植以及氣候變化等原因，雪蓮果種植的各個(gè)時(shí)期葉腐病、鐮刀葉斑病、褐斑病、紫斑病等葉部病害發(fā)生較為嚴(yán)重，且有逐年加重的趨勢(shì)，對(duì)其生產(chǎn)帶來了較大的危害，但國內(nèi)外學(xué)者對(duì)雪蓮果葉部病害尤其是葉腐病進(jìn)行系統(tǒng)研究的資料甚少，這顯然已不適應(yīng)當(dāng)前雪蓮果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展要求[5]。由此可知，研究雪蓮果葉腐病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律及防治措施對(duì)雪蓮果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大的理論和現(xiàn)實(shí)意義。鑒于此，本研究在攀西地區(qū)特定條件下，對(duì)雪蓮果葉腐病進(jìn)行了病原菌鑒定和生物學(xué)特性研究，為雪蓮果種植及病害的防治提供一定的理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離、純化及鑒定

1.1.1 樣本采集及病原菌分離

病害樣本采集于西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院試驗(yàn)田（該試驗(yàn)田雪蓮果種植的整個(gè)時(shí)期均未施用任何化學(xué)農(nóng)藥），對(duì)葉部（葉面、葉緣、葉尖）病害進(jìn)行癥狀觀察和記錄并帶回實(shí)驗(yàn)室供室內(nèi)試驗(yàn)。參照《植病研究方法》中病原真菌的組織分離法[6]對(duì)葉片上的病原菌進(jìn)行分離、純化，并經(jīng)單孢分離獲得純培養(yǎng)菌株。

1.1.2 病原菌形態(tài)特征觀察與鑒定 將菌株移于PDA平板上，置于22 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察記錄病原菌的培養(yǎng)性狀。經(jīng)過PDA培養(yǎng)純化后，挑取所得的純菌株制片，并在顯微鏡下觀察病原菌孢子的形態(tài)特征。根據(jù)以上性狀并查閱相關(guān)文獻(xiàn)，初步判定病原菌的種類。

1.1.3 病原菌的科赫氏法則鑒定 用所得的菌株配成孢子懸浮液，采用刺傷和無傷接種法[7-8]，把孢子液涂于雪蓮果的健康葉片上，以無菌水涂抹葉片保濕作對(duì)照，然后將接種的雪蓮果葉片放入具有濕潤無菌紙的培養(yǎng)皿中，置于22 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng)。每處理重復(fù)3次，觀察和記錄接種結(jié)果，比較其發(fā)病癥狀是否與初次分離時(shí)的癥狀一致，并對(duì)接種成功的病斑再次進(jìn)行組織分離，確認(rèn)致病菌株。

1.2 雪蓮果葉腐病病原菌生物學(xué)特性研究

處理的設(shè)置分別如下：選擇燕麥培養(yǎng)基、PDA、PSA、玉米培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基共5種不同培養(yǎng)基進(jìn)行雪蓮果葉腐病病原菌最佳培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)，其最優(yōu)結(jié)果作為其他試驗(yàn)所采用的培養(yǎng)基；病菌最適培養(yǎng)pH值試驗(yàn)分別設(shè)置pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的6個(gè)pH值梯度，篩選得到的最佳pH值作為后續(xù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)條件；病菌適宜培養(yǎng)溫度試驗(yàn)設(shè)置18、20、22、24、26、28、30 ℃共7個(gè)溫度梯度，所得出的最佳溫度作為后續(xù)試驗(yàn)培養(yǎng)該菌的基本溫度；病菌最佳培養(yǎng)濕度試驗(yàn)設(shè)置35%、50%、65%、75%、79.8%和88%共6個(gè)梯度；光照對(duì)菌落生長的影響試驗(yàn)設(shè)全黑暗、半光照（日光燈照射12 h光暗交替）和全光照3個(gè)處理。以上各試驗(yàn)每處理均做3次重復(fù)。

將活化的菌種用打孔器打成直徑為0.4 cm的菌餅，分別接種后放到不同試驗(yàn)條件下培養(yǎng)，采用“十”字交叉法逐日測量菌落直徑并觀察生長情況。

將各項(xiàng)試驗(yàn)記錄數(shù)據(jù)分別錄入相應(yīng)的數(shù)據(jù)文件，用Microsoft Excel和SigmaPlot 10.0軟件計(jì)算各處理的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌鑒定

2.1.1 病原菌癥狀描述

該病危害雪蓮果葉片，初期病部為淡黃色圓形或不規(guī)則小點(diǎn)，無明顯暈圈，后期病斑沿葉脈呈條形散射狀擴(kuò)大，繼而連成一片，天氣潮濕時(shí)葉片腐爛，其上產(chǎn)生大量黑褐色霉層（圖1）。

2.1.2 病原菌的培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征

病原菌在PDA培養(yǎng)基上菌落呈絨毛狀，不規(guī)則圓形，菌絲初期呈灰白色至灰褐色，后期菌落表面顏色有明顯分層現(xiàn)象，菌落中間灰黑色，邊緣灰白色；接種1～2 d內(nèi)氣生菌絲以垂直生長為主，菌落隆起高度可達(dá)1 cm，接種3 d后菌絲橫向生長速度加快，接種 6 d 后菌絲成熟，其頂端出現(xiàn)黑色小粒點(diǎn)，開始產(chǎn)孢（圖2）。菌絲直徑0.82～2.87（平均1.63） μm，早期菌絲無隔，后期逐漸產(chǎn)生隔膜；無性孢子為分生孢子，孢子有隔，單生或串生呈球形、卵形至長圓形，大小在7.12～13.79（平均9.72） μm×1.98～7.54（平均4.57） μm范圍內(nèi)；節(jié)間產(chǎn)生小格孢，成不規(guī)則的灰黑色四邊形，格孢大小為3.30～14.41（平均9.88） μm×1.83～8.22（平均494） μm（圖3）。

2.1.3 科赫氏法則證病

把從發(fā)病部位分離獲得的病原菌菌株回接到健康無病的雪蓮果葉片上，刺傷接種的葉片5 d后開始發(fā)病，無傷接種的葉片10 d后開始發(fā)病。無論是刺傷接種還是無傷接種，其癥狀特點(diǎn)與自然發(fā)病葉片相同，清水對(duì)照不發(fā)病。從接種的病組織分離的病原菌與自然發(fā)病組織分離的病原菌形態(tài)一致。

根據(jù)病原菌癥狀特點(diǎn)、形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀及科赫氏證病結(jié)果，并參考相關(guān)文獻(xiàn)，確定從該地區(qū)雪蓮果葉片上分離得到的病原菌為鏈格孢屬（Alternaria spp.）真菌。

2.2 雪蓮果葉腐病病原菌生物學(xué)特性研究

2.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)雪蓮果葉腐病菌菌絲生長情況的影響 經(jīng)活化后的雪蓮果葉腐病菌在5種培養(yǎng)基中均可正常生長，各菌落生長的平均直徑大小不一（圖4）。在PDA、PSA培養(yǎng)基中生長無顯著性差異，它們與其他培養(yǎng)基上的菌落平均直徑呈極顯著差異（P<0.01），在玉米培養(yǎng)基中生長最慢。在5種培養(yǎng)基上菌株的直徑大小依次為：PDA>PSA>燕麥>牛肉膏蛋白胨>玉米培養(yǎng)基。其中，菌株被培養(yǎng)96 h時(shí)菌落直徑在PDA培養(yǎng)基中優(yōu)先達(dá)到最大，達(dá)7.13 cm，且菌絲灰白、濃密，整齊度高。因此，PDA培養(yǎng)基是雪蓮果葉腐病菌生長的最佳培養(yǎng)基，并且在接下來的pH值、溫度、濕度和光照條件的試驗(yàn)中均采用該培養(yǎng)基作為該菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.2.2 不同pH值對(duì)雪蓮果葉腐病菌菌絲生長情況的影響 將經(jīng)活化后的雪蓮果葉腐病菌接種到不同pH值的PDA培養(yǎng)基上，菌株在pH值為4.0～9.0范圍內(nèi)均能生長。pH值為4.0～7.0范圍內(nèi)菌株的菌落平均直徑隨pH值增加而增加；pH值為 80～9.0 時(shí)，菌落平均直徑隨pH值升高而減小 （圖5）。菌株在pH值為4.0時(shí)生長最慢，培養(yǎng)7 d時(shí)其菌落平均直徑僅為2.8 cm；在pH值為7.0的培養(yǎng)基中生長良好，培養(yǎng)7 d時(shí)其平均菌落直徑達(dá)到7.17 cm，與其他各處理間差異達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。因此，通過該試驗(yàn)可以得出雪蓮果葉腐病菌的最適宜生長pH值為7.0。因此，在接下來的溫度、濕度和光照條件的試驗(yàn)中均采用該pH值條件為其基本培養(yǎng)條件。

2.2.3 不同溫度對(duì)雪蓮果葉腐病菌菌絲生長情況的影響 圖6表明，各種溫度下菌落平均直徑有明顯的差異，溫度是影響菌株生長的重要因子。菌株在18～30 ℃都能生長，但生長的適溫范圍是24～26 ℃，以26 ℃最佳，在此溫度下培養(yǎng)的菌落生長最快且菌絲濃密整齊，培養(yǎng)7 d時(shí)平均菌落直徑達(dá)到6.97 cm，與其他各處理間差異極顯著（P<0.01）。當(dāng)培養(yǎng)溫度為18 ℃和30 ℃時(shí)菌絲生長受到抑制，培養(yǎng)7 d時(shí)其菌落平均直徑最小，分別僅為2.77 cm和2.97 cm， 與其他處理呈極顯著差異。以上結(jié)果說明，雪蓮果葉腐病菌生長的最適溫度為26 ℃，溫度過高或過低均不利于該菌株生長。因此，在接下來的濕度和光照條件試驗(yàn)中均采用該溫度條件為該菌的基本生長條件。

2.2.4 不同濕度對(duì)雪蓮果葉腐病菌菌絲生長情況的影響 將在pH值為7.0的PDA培養(yǎng)基上以26 ℃恒溫培養(yǎng)的雪蓮果葉腐病菌在不同濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，菌株的生長情況如圖7所示。該菌在供試濕度范圍35%～88%內(nèi)均可生長，在濕度為50%～75%時(shí)生長較快，以65%最佳，此條件下培養(yǎng)的菌落生長最快，培養(yǎng)7 d時(shí)其平均菌落直徑高達(dá)7.10 cm，與其他濕度條件的處理差異極顯著（P<0.01），而當(dāng)濕度為88%和35%時(shí)菌絲生長受到抑制，其菌落直徑最小。通過該試驗(yàn)可以得出雪蓮果葉腐病菌的最適宜生長濕度為65%，并將其作為光照條件試驗(yàn)的濕度條件。

2.2.5 不同光照條件對(duì)雪蓮果葉腐病菌菌絲生長的影響 將經(jīng)活化后的雪蓮果葉腐病菌菌絲塊接種到pH值為7.0的PDA培養(yǎng)基上，在溫度26 ℃、濕度為65%條件下置于不同光照環(huán)境中培養(yǎng)，該菌株均能夠正常生長，在全光照、半光照、全黑暗的生長條件下菌落的生長直徑之間沒有顯著性差異，不同的光照條件對(duì)雪蓮果葉腐病菌的生長影響不大（圖8）。

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)雪蓮果葉腐病癥狀的觀察、病原菌的分離培養(yǎng)以及病原菌的鑒定，確定雪蓮果葉腐病病原菌為鏈格孢屬（Alternari spp.）真菌。

病原菌生物學(xué)特性試驗(yàn)中分別研究了不同培養(yǎng)基、pH值、溫度、濕度和光照條件對(duì)雪蓮果葉腐病菌生長情況的影響，采用只允許一個(gè)變量發(fā)生變化，而其他量不變的單因素試驗(yàn)方法，通過分步驟試驗(yàn)，并進(jìn)行單因素方差分析找出相應(yīng)的顯著性關(guān)系，最后依次找出最佳試驗(yàn)因子。結(jié)果表明，雪蓮果葉腐病菌的最適生長培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，最佳pH值為7.0，最適生長溫度為26 ℃，最適生長濕度為65%，光照對(duì)其影響不大。這些結(jié)果與王仕玉等對(duì)齒瓣石斛病原鏈格孢菌（Alternaria tenuis）和王春江等對(duì)小麥鏈格孢（Alternaria triticina）的生物學(xué)特性研究的結(jié)果[9-10]基本相近，僅在對(duì)pH值變化的反應(yīng)方面存在一定的差異。這可能是由于菌株在不同的地域及寄主植物上產(chǎn)生不同的寄生適應(yīng)性，而這些適應(yīng)性導(dǎo)致其在某些生物學(xué)特性上可能顯示出一定的差別。

本研究明確了雪蓮果葉腐病的致病病原菌及該菌的主要生物學(xué)特性，為進(jìn)一步研究該菌奠定了基礎(chǔ)，對(duì)于有效控制該病提供了重要的參考價(jià)值。

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