shRNA干擾PLCε1基因?qū)θ耸彻馨〦ca109細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響

周榮秒，李 賓，牛朝旭，王 娜，黃 茜，霍向然，李 琰*

(1.河北醫(yī)科大學(xué) 第四醫(yī)院 河北省腫瘤研究所 分子生物學(xué)研究室， 河北 石家莊 050011; 2.石家莊平安醫(yī)院 外科， 河北 石家莊 050021)

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shRNA干擾PLCε1基因?qū)θ耸彻馨〦ca109細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響

周榮秒1，李 賓1，牛朝旭2，王 娜1，黃 茜1，霍向然1，李 琰1*

(1.河北醫(yī)科大學(xué) 第四醫(yī)院 河北省腫瘤研究所 分子生物學(xué)研究室， 河北 石家莊 050011; 2.石家莊平安醫(yī)院 外科， 河北 石家莊 050021)

目的探討沉默PLCε1基因?qū)κ彻馨〦ca109細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響及其可能的機(jī)制。方法PLCε11、PLCε12和PLCε13質(zhì)粒表達(dá)載體用于沉默PLCε1，通用陰性對照質(zhì)粒表達(dá)載體HK作為對照。用陽離子脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，篩選出干擾效果最好的質(zhì)粒表達(dá)載體(PLCε12)。實(shí)驗(yàn)分為Eca109組、HK組和PLCε12組。MTT檢測細(xì)胞的存活率。FCM檢測細(xì)胞周期，RT-PCR檢測細(xì)胞P16、CyclinD1基因 mRNA表達(dá)。結(jié)果HK、PLCε12質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞后48和72 h，PLCε12組Eca109細(xì)胞的存活率分別為80.73%和75.88%，顯著低于HK組(P<0.001)。Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h，PLCε12組處于S期的細(xì)胞比例明顯低于HK組(P<0.01)，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞48 h后，PLCε12組Eca109細(xì)胞P16基因mRNA表達(dá)水平明顯高于HK組(P<0.01)。結(jié)論沉默PLCε1基因可能通過上調(diào)Eca109細(xì)胞P16基因的表達(dá)，阻止細(xì)胞周期從G1期向S期的過渡，抑制Eca109細(xì)胞的增殖活性。

PLCε1基因；食管癌；RNA干擾；增殖

PLCε1是磷脂酶C家族成員之一，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、凋亡和血管形成，在腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮促進(jìn)或抑制作用[1- 3]。另外，PLCε1在腫瘤的進(jìn)展過程中也有極其重要的作用[4]。食管癌的研究表明，PLCε1在食管癌組織中的表達(dá)高于其癌旁正常食管組織[5- 6]，PLCε1的表達(dá)上調(diào)與較晚的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[6]。但是，PLCε1基因如何影響食管癌細(xì)胞的增殖行為和細(xì)胞周期目前尚未見報(bào)道。本研究采用RNA干擾技術(shù)沉默食管癌Eca109細(xì)胞PLCε1基因，觀察Eca109細(xì)胞增殖行為和細(xì)胞周期的變化，并探討其可能的機(jī)制，為食管癌的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人食管癌細(xì)胞系Eca109(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心惠贈(zèng))，PLCε1 shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體(PLCε11、PLCε12和PLCε13)和通用陰性對照質(zhì)粒表達(dá)載體(HK)(武漢淅瑪生物技術(shù)有限公司構(gòu)建)，F(xiàn)uGEN?HD Transfection Reagent(Promega公司)，PCR引物合成(上海生工生物工程有限公司)，兔抗人PLCε多克隆抗體(Upstate公司)，兔抗人GAPDH多克隆抗體(杭州賢至生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

Eca109組(只加FuGEN?HD Transfection Reagent)、HK組(轉(zhuǎn)染HK質(zhì)粒)、PLCε11組(轉(zhuǎn)染PLCε11質(zhì)粒)、PLCε12組(轉(zhuǎn)染PLCε12質(zhì)粒)和PLCε13組(轉(zhuǎn)染PLCε13質(zhì)粒)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

食管癌細(xì)胞系Eca109用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2及95%空氣飽和濕度的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長至70%～80%匯合時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。6孔板質(zhì)粒與脂質(zhì)體的比為2 μg：6 μL，轉(zhuǎn)染按照FuGEN?HD Transfection Reagent說明書進(jìn)行。

1.4 RT-PCR法檢測PLCε1基因 mRNA表達(dá)

轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組Eca109細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR方法檢測PLCε1基因mRNA表達(dá)。PLCε1基因上、下游引物分別為5′-TAACTGAC GATGAGATGGCAAC-3′和5′-TGTTTGAAGAAGAC AGCACAGG-3′，產(chǎn)物大小為246 bp；GAPDH基因上、下游引物分別為5′-ACCACAGTCCATGCCATC AC-3′和5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，產(chǎn)物大小為452 bp。Gene Tools軟件分析擴(kuò)增產(chǎn)物的吸光度(absorbance value，A value)，計(jì)算PLCε1基因A值與內(nèi)參GAPDH基因A值的比值，對PLCε1基因mRNA表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行吸光度半定量分析，挑選干擾效果最好的質(zhì)粒表達(dá)載體。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blot法檢測PLCε1蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組Eca109細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解后提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，BCA法檢測蛋白濃度，行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上。PVDF膜分別與一抗PLCε(1∶250)、GAPDH(1∶1 000)孵育，4 ℃過夜。TBST洗膜3次，PVDF膜置入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液(1∶3 000)中，37 ℃孵育1.5 h。TBST洗膜3次， ECL發(fā)光法顯色。顯色條帶掃描后用Bio1D軟件進(jìn)行檢測，測定PLCε1蛋白與GAPDH蛋白產(chǎn)物條帶的吸光度值。用PLCε1蛋白與GAPDH蛋白的吸光度比值作為PLCε1蛋白的相對含量，挑選干擾效果最好的質(zhì)粒表達(dá)載體。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 MTT法檢測Eca109細(xì)胞的增殖能力

轉(zhuǎn)染后24 h，0.25%胰蛋白酶消化各組Eca109細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL。稀釋好的細(xì)胞用于接種96孔板，共3板，每孔200 μL細(xì)胞，每96孔板各實(shí)驗(yàn)組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。上述96孔板細(xì)胞分別于接種后24、48和72 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液。每孔加入150 μL DMSO，搖床振蕩10 min。在酶標(biāo)儀上測定490 nm波長下各孔的吸光度值，按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的吸光度值/Eca109組的吸光度值×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 FCM法檢測Eca109細(xì)胞的細(xì)胞周期

轉(zhuǎn)染后24 h，0.25%胰蛋白酶消化各組Eca109細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌，1 500 r/min離心5 min，重復(fù)2次，棄去PBS緩沖液，加入5 mL 70%冰乙醇固定細(xì)胞6 h以上，4 ℃保存。流式細(xì)胞儀檢測前，棄去固定細(xì)胞的70%冰乙醇，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每次1 500 r/min離心5 min。調(diào)整每份樣品的細(xì)胞數(shù)為1×107個(gè)/mL，取100 μL細(xì)胞懸液，加入DNA染液(PI 50 μg/mL，RNA 酶10 μg/mL及1% Triton-X100)1 mL，于4 ℃冰箱中染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。應(yīng)用Muticycle AV軟件對細(xì)胞周期進(jìn)行分析。依據(jù)DNA細(xì)胞周期擬合分析所得的組方圖進(jìn)行計(jì)算，得出各時(shí)相的百分比。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8RT-PCR法檢測P16、CyclinD1基因mRNA表達(dá)

轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組Eca109細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR方法檢測P16、CyclinD1基因mRNA表達(dá)。P16基因上、下游引物分別為5′-CTTCC TGGACACGCTGGT-3′和5′-ATCTATGCGGGCATGG TTACT-3′，產(chǎn)物大小為172 bp；CyclinD1基因上、下游引物分別為5′-CGGAGGAGAACAAACAGATCAT-3′和 5′-AGGCGGTAGTAGGACAGGAGT-3′，產(chǎn)物大小為175 bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的定量與PLCε1基因mRNA表達(dá)的測定相同。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各質(zhì)粒表達(dá)載體的RNA干擾效果

PLCε11、PLCε12和PLCε13組Eca109細(xì)胞PLCε1基因mRNA的表達(dá)水平均顯著低于Eca109組和HK組(P<0.05)。PLCε11、PLCε12和PLCε13質(zhì)粒表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染均可顯著降低Eca109細(xì)胞PLCε1蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)，以PLCε12質(zhì)粒表達(dá)載體的干擾效果最為顯著。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取PLCε12質(zhì)粒表達(dá)載體沉默Eca109 細(xì)胞PLCε1基因(圖1，表1)。

表1 轉(zhuǎn)染后48 h Eca109細(xì)胞PLCε1基因mRNA和蛋白的表達(dá)

*P<0.05 compared with HK group.

A:1.100 bp DNA Marker; 2.Eca109 cells; 3.Eca109 cells transfected with HK; 4～6.Eca109 cells transfected with PLCε11, PLCε12 and PLCε13, respectively; B:1.Eca109 cells; 2.Eca109 cells transfected with HK; 3～5.Eca109 cells transfected with PLCε11, PLCε12 and PLCε13, respectively

2.2PLCε12質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對Eca109細(xì)胞增殖的影響

HK、PLCε12質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞后48和72 h，PLCε12組Eca109細(xì)胞的存活率顯著低于HK組(P<0.001)；然而，轉(zhuǎn)染后96 h，HK組與PLCε12組Eca109細(xì)胞的存活率無差異(表2)。

表2 轉(zhuǎn)染HK或 PLCε12質(zhì)粒后Eca109細(xì)胞的存活能力

*P<0.001 compared with HK group.

2.3PLCε12質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對Eca109細(xì)胞的細(xì)胞周期分布影響

PLCε12組處于S期的Eca109細(xì)胞比例明顯低于HK組(P<0.01)，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期(圖2，表3)。

表3 轉(zhuǎn)染后24 h Eca109細(xì)胞的細(xì)胞周期分布

*P<0.01 compared with HK group.

2.4PLCε12質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對Eca109細(xì)胞P16、CyclinD1基因表達(dá)的影響

PLCε12組Eca109細(xì)胞P16基因 mRNA表達(dá)水平明顯高于HK組Eca109細(xì)胞(P<0.01)。HK組與PLCε12組Eca109細(xì)胞CyclinD1基因mRNA表達(dá)水平無差異(圖3，表4)。

表4 轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞P16和CyclinD1基因mRNA表達(dá)

*P<0.01 compared with HK group.

A.Eca109; B.HK; C.PLCε12圖2 轉(zhuǎn)染后24 h Eca109細(xì)胞細(xì)胞周期分布Fig 2 The cell cycle distribution of Eca109 cells after transfection 24 hours

A.P16; B.CyclinD1; 1.100 bp DNA Marker; 2.Eca109 cells transfected with HK; 3.Eca109 cells transfected with PLCε12圖3 轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞P16和CyclinD1基因mRNA表達(dá)Fig 3 P16 and CyclinD1 gene mRNA expression of transfected Eca109 cells

3 討論

以往對泌尿系腫瘤進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，PLCε1基因通過不同的機(jī)制調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖[7- 8]，本研究亦表明抑制PLCε1基因的表達(dá)，抑制了Eca109細(xì)胞的存活能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)沉默Eca109細(xì)胞PLCε1基因可能通過調(diào)控細(xì)胞周期的分布影響細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞周期紊亂在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。參與細(xì)胞周期調(diào)控的主要因子有：細(xì)胞周期素、周期蛋白依賴性激酶和周期蛋白依賴性激酶抑制劑。G1期向S期的過渡是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)，CyclinD1、CDK4以及P16基因在這一過程中起著重要的作用。在G1期，CyclinD1與CDK4或CDK6結(jié)合形成復(fù)合物，再通過其氨基末端的LECXE基序與Rb結(jié)合，使Rb的Ser和Tyr殘基磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，使得E2F依賴性基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，完成細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)化。P16蛋白可以抑制CDK4的活性，阻止細(xì)胞從G1期向S期的過渡。本研究表明，沉默PLCε1基因可能通過上調(diào)P16基因的表達(dá)，抑制Eca109細(xì)胞向S期的過渡，使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞的增殖。沉默PLCε1上調(diào)P16基因表達(dá)可能的機(jī)制：PLCε1被激活后，催化磷脂酰肌醇4,5- 二磷酸(PIP2)水解為三磷酸肌醇(IP3)和二酯酰甘油(DAG)。IP3引起Ca2+從細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫向細(xì)胞質(zhì)的釋放；DAG和Ca2+激活蛋白激酶C(PKC)，PKC激活后可以磷酸化立早基因c-fos、c-jun的反式作用因子，使c-fos、c-jun表達(dá)增強(qiáng)。Fos、Jun蛋白磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞系，通過亮氨酸拉鏈形成激活蛋白- 1(activating protein 1，AP- 1)。AP- 1是核轉(zhuǎn)錄因子，可以上調(diào)CyclinD1基因的表達(dá)、下調(diào)P16基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖[10- 11]。因此，沉默PLCε1上調(diào)了P16基因表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖。盡管CyclinD1在食管癌的發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[12]，本研究提示沉默PLCε1并未影響Eca109細(xì)胞CyclinD1的表達(dá)。

總之，沉默PLCε1基因可能通過上調(diào)Eca109細(xì)胞P16基因的表達(dá)，阻止細(xì)胞周期從G1期向S期的過渡，抑制Eca109細(xì)胞的增殖活性。PLCε1基因可以作為食管癌基因治療的靶點(diǎn)。

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Effect of shRNA interferingPLCε1 gene on proliferation and cell cycle of human esophageal carcinoma Eca109 cells

ZHOU Rong-miao1, LI Bin1, NIU Chao-xu2, WANG Na1, HUANG Xi1, HUO Xiang-ran1, LI Yan1*

(1.Dept. of Molecular Biology, Hebei Provincial Cancer Institute, the Fourth Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011; 2.Dept. of Surgery, Shijiazhuang Ping’an Hospital, Shijiazhuang 050021, China)

ObjectiveTo explore the impact of silencingPLCε1 gene on proliferation and cell cycle of esophageal carcinoma Eca109 cells.MethodsThree plasmid expression vectors (PLCε11, PLCε12 and PLCε13) were constructed to silencePLCε1 gene. A negative control plasmid expression vector (HK) was constructed at the same time to serve as a control. The plasmid expression vectors were transfected into esophageal carcinoma Eca109 cells by cations liposome. The plasmid expression vector with the best interference effect (PLCε12) was chosen. The study included Eca109 group, HK group and PLCε12 group. Cell viability of Eca109 cells was evaluated by MTT assay. The cell cycles were detected by FCM. The mRNA expression ofP16 andCyclinD1 gene was measured by RT-PCR.ResultsThe cell viabilitys of Eca109 cells in PLCε12 group were 80.73% and 75.88% at 48 and 72 h after transfection, which were significantly lower than that of Eca109 cells in HK group (P<0.001). The percentage of S phase Eca109 cells in

PLCε1 gene; esophageal carcinoma; RNA interference; proliferation

2014- 06- 23

：2014- 09- 25

*通信作者(correspondingauthor)：lykx1962@163.com

1001-6325(2015)02-0208-05

研究論文

R 737.11

：A

PLCε12 group was lower than that of Eca109 cells in HK group (P<0.01), the cell cycle of PLCε12 group Eca109 cells was arrested in G0/G1phase. TheP16 gene mRNA expression of PLCε12 group Eca109 cells was higher than that of HK group Eca109 cells (P<0.01).ConclusionsSilencingPLCε1 gene may up-regulateP16 gene mRNA expression and then arrest the cell cycle at G0/G1phase and so inhibit proliferation of Eca109 cells.