念珠狀鏈桿菌Taqman MGB熒光定量PCR檢測方法的建立與初步應用

邢 進，馮育芳，岳秉飛，賀爭鳴，戴方偉，薩曉嬰，代解杰

(1.中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050;2.浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心，杭州 310013;3.中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所，昆明 650118)

念珠狀鏈桿菌(Streptobacillus moniliformis)是一種革蘭氏陰性桿菌，作為重要的人獸共患病原［1］，可存在于各種正常鼠類或病鼠的口咽部、中耳及上呼吸道，具有高度多形性，在多種實驗動物中都有發(fā)現(xiàn)，是人類鼠咬熱(rat-bite fever)和哈佛山熱(Haverhill fever)的病原［2，3］。該菌在國內 C57BL/6J和 KM 小鼠中曾爆發(fā)自然感染［4，5］，被列為實驗動物清潔級動物必要時檢測的項目［6］。分離培養(yǎng)是該菌最常規(guī)和經典的檢測方法，而因其對營養(yǎng)和氣體條件要求較高，培養(yǎng)相對困難［1］，很容易造成漏檢。鑒于其危害程度，已有很多念珠狀鏈桿菌檢測方法的研究，如間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)［7］、普通 PCR 方法［8，9］，免疫印跡(IB)［10］、質譜分析法(ESI-MS)［11］和蛋白芯片法［12］等。這些方法多存在特異性、敏感性和操作復雜能問題。近年來已經廣泛應用在病原檢測的Taqman MGB熒光定量PCR方法［13］以其極高的特異性、靈敏度和檢測效率，已經成為臨床上的重要檢測手段。目前在國內外還未見有應用熒光定量PCR方法檢測念珠狀鏈桿菌的報道。本研究應用該技術，建立了一種對念珠狀鏈桿菌的實時熒光定量PCR檢測方法，并成功的在動物樣本中進行了初步應用。

1 材料

1.1 標準菌株和質粒

1.1.1 標準菌株:念珠狀鏈桿菌(ATCC14647)陽性菌株和23株對照參考菌株:沙門氏菌(CMCC47001)、大腸桿菌(CMCC44711)、肺炎鏈球菌 (CMCC31210、CMCC36001)、糞鏈球菌(CMCC32219)、支氣管鮑特桿菌(CMCC58401)、多殺巴斯德桿菌(ATCC43137)、嗜肺巴斯德桿菌(ATCC12555)、小鼠放線桿菌(ATCC49577)、肺炎支原體(ATCC15531)、肺支原體(ATCC19612)、鼠棒狀桿菌(CMCC65013)、假結核也爾森氏菌(CMCC53501)、小腸結腸炎耶爾森氏菌(CMCC52301)、綠膿桿菌(ATCC27853)、單核細胞增生性李斯特桿菌(CMCC54004)、宋內氏志賀菌(CMCC51082)、金黃色葡萄球菌(CMCC25923)、嚙齒類枸櫞酸桿菌(ATCC BAA-352)、陰溝腸桿菌(CMCC13047)、乙型溶血性鏈球菌(CMCC32210)、白色念珠菌(CMCC10231)、肺炎克雷柏桿菌(CMCC46108)。

1.1.2 標準品質粒:念珠狀鏈桿菌目的片段轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109由寶生物工程(大連)有限公司合成制備，本室保存。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基購自美國 Oxiod，Nuclease-Free Water購自美國Promaga，DNA提取試劑盒QIAamp 96 DNA QIAcube Kit購自德國Qiagen，Taqman Gene Expression Master Mix購自美國ABI。

1.3 動物樣本

共823份實驗動物呼吸道樣本，包括358份小鼠氣管、90份大鼠氣管、110份豚鼠氣管、10份地鼠氣管、130份兔咽拭子、65份沙鼠氣管收集于北京地區(qū)，60份野生馴化樹鼩呼吸道樣本由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所提供。

1.4 儀器設備

德國Qiagen QIAcube自動核酸提取儀，美國Thermo Fisher A2生物安全柜，美國ABI 7500Fast熒光定量 PCR儀，上海安亭 WGP-600隔水恒溫培養(yǎng)箱。

2 方法

2.1 念珠狀鏈桿菌的培養(yǎng)和DNA的提取

將復蘇后凍存的菌種接種于哥倫比亞血瓊脂平皿，置37℃培養(yǎng)48 h。菌落使用Qiagen基因組DNA提取試劑盒提取念珠狀鏈桿菌、其他23株參考菌株及動物樣品的基因組DNA，操作根據(jù)試劑盒說明進行。

2.2 引物和探針

念珠狀鏈桿菌此前被劃分為Fusobacteriaceae菌科［14］，而經過近兩年的最新研究，目前將念珠狀鏈桿菌與另三個屬的菌株 Sebaldella，Sneathia和Leptotrichia重新組成了 Leptotrichiaceae菌科［15］。因此將念珠狀鏈桿菌在內的8株Leptotrichiaceae菌科菌株，以及NCBI Genbank中已知的11株念珠狀鏈桿菌16S rRNA應用Vector NTI advance11進行同源性分析，應用Primer Express 3.0根據(jù)16S V3可變區(qū)序列設計Taqman MGB熒光定量PCR引物和探針(圖1)。上游引物 SmF 24 bp:5’-TTTTCGGATT GTAAAGTGCTTTCA-3’，下游引物 SmR 23 bp:5’-TTTAGCCGTCGCTTCTTCTGTAG-3’，Sm-MGB probe 23 bp:FAM5’-TAGGGAAGAAGAAGATGACGGTA-3’MGBNFQ，目的片段長度72 bp。引物和探針由美國ABI公司合成制備。

2.3 念珠狀鏈桿菌Taqman MGB探針熒光定量PCR(qPCR)檢測方法的建立

2.3.1 標準曲線的繪制:將質粒作10倍梯度稀釋，濃度為1×109～1拷貝/μL。通過對標準質粒的擴增，優(yōu)化并確定實時qPCR的反應體系和最佳反應條件?？偡磻w系20 μL，20×上、下游引物(各 18 μmol/L)和探針(5 μmol/L)混合液 0.5 μL，2 × TaqMan? Gene Expression Master Mix 10 μL，模板 DNA 1 μL，Nuclease-Free Water 8.5 μL。擴增條件:50℃ 2 min，95℃10 min 各 1 個循環(huán);95℃15 s，59℃1 min 40個循環(huán)。每個稀釋度的標準品同時重復進行3個反應，并用無菌水為模板作為陰性對照。取適宜質粒稀釋度的擴增結果繪制標準曲線。

2.3.2 特異性驗證:用合成的引物和探針對23株標準菌株進行qPCR反應，觀察所建立方法與其他參考菌株有無交叉反應。

2.3.3 敏感性檢測:去標準品質粒進行10倍梯度稀釋，以濃度為1× 109拷貝/μL、1× 108拷貝 μL、1× 107拷貝/μL、1 ×106拷貝/μL、1 ×105拷貝/μL、1 ×104拷貝/μL、1 ×103拷貝/μL、100 拷貝/μL、10 拷貝/μL 和1 拷貝/μL 各1 μL 作為模板，按上述條件進行qPCR擴增。

2.3.4 重復性檢測:以濃度為1×108～1×104拷貝/μL的質粒標準品作為模板，重復進行3次qPCR反應，3次反應的Ct值結果用作組間比對。將標準曲線繪制時的3次重復反應結果用作組內比對。通過計算標準偏差和變異系數(shù)分析該方法的重復性。

2.3.5 樣品檢測:用所建立的方法對小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、沙鼠和樹鼩的呼吸道樣本進行檢測，所得結果與經典的分離培養(yǎng)法進行比較。

3 結果

3.1 標準曲線

取適宜質粒稀釋度1×108～1×104拷貝/uL的擴增結果繪制標準曲線。標準曲線方程為Y=-3.34X+43.018，相關系數(shù)R2=0.999，擴增效率為99.255%(圖2)。

3.2 特異性

該方法對23株標準菌株進行qPCR反應，無交叉反應發(fā)生(圖3)。念珠狀鏈桿菌陽性對照的初始濃度與1×107拷貝/μL的濃度相當，陰性空白對照無擴增曲線產生。

圖1 Leptotrichiaceae菌株16 S rRNA序列分析Fig.1 Analysis of the 16 S rRNA of Leptotrichiaceae strain

圖2 念珠狀鏈桿菌Real-time PCR標準曲線Fig.2 Standard curve of the TaqMan MGB probe real time quantitative PCR for S.moniliformis

3.3 敏感性

用倍比稀釋的重組質粒作為標準陽性模板進行qPCR(圖4)。所建qPCR的最低檢測限為10拷貝/μL。

3.4 重復性

對質粒標準品1×109copies/μL～100 copies/μL同時重復3次 qPCR，對1×108copies～1×104copies分3次進行qPCR擴增。所得Ct值計算變異系數(shù)(CV)，組內變異系數(shù)在0.10～2.31%，組間在0.23～3.67%，均在5%以下，表明重復性了良好，具體結果見表1，表2。

3.5 動物中念珠狀鏈桿菌的檢測結果

用所建立的念珠狀鏈桿菌Taqman MGB qPCR檢測方法檢測小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、長爪沙鼠和野生樹鼩共823份動物呼吸道樣本進行檢測，結果小鼠、大鼠、豚鼠和兔的結果全部為陰性，長爪沙鼠陽性率為1.5%(1/65)，樹鼩陽性率為61.7%(37/60)。

4 討論

16 S rRNA V3高可變區(qū)是引物探針設計的理想?yún)^(qū)域［16］。本研究根據(jù)此區(qū)域所設計的Taqman引物和MGB探針，能夠非常有效的區(qū)別包括念珠狀鏈桿菌在內的眾多屬種的菌株，同時與Fusobacteriaceae菌科其他菌屬菌株的比對，保證了所建方法良好的特異性和敏感性。此前荷蘭學者Boot所建立的念珠狀鏈桿菌16 S rRNA普通PCR檢測方法敏感性可達 2～6 copis/μL，但是對Fusobacterium necrogenes和Sebaldella termitidis也會出現(xiàn)非特異的陽性條帶，須利用限制性內切酶BfaI對產物進行酶切才能夠區(qū)分［8］。

表1 念珠狀鏈桿菌qPCR組內重復性檢測Tab.1 Repeatability verification of S.moniliformis real-time quantitative PCR intra-assay in the same sample in different concentrations

表2 念珠裝鏈桿菌qPCR組間重復性檢測Tab.2 Repeatability verification of S.moniliformis real-time quantitative PCR inter-assay in different samples in different concentrations

圖3 qPCR檢測念珠狀鏈桿菌特異性和沙鼠樣品檢測結果Fig.3 Specificity of the Mongolian gerbil samples and the results of TaqMan MGB probe real time quantitative PCR for S.moniliformis.

圖4 qPCR檢測念珠狀鏈桿菌敏感性結果Fig.4 Sensitivity results of TaqMan MGB probe real time quantitative PCR for S.moniliformis.

用本研究所建立的Taqman MGB qPCR方法對北京地區(qū)絕大部分實驗動物中未檢出念珠狀鏈桿菌的存在，與培養(yǎng)法的檢測結果相符。而在普通級長爪沙鼠和野生樹鼩中檢測出陽性，與此前的研究結果不同，分離培養(yǎng)法未分離得到念珠狀鏈桿菌［17］。這與 R.Boot的研究結果相符，用 PCR和ELISA方法能夠檢測出陽性的人工感染大鼠，用培養(yǎng)法則不能檢出［8］。念珠狀鏈桿菌對培養(yǎng)條件要求相對較高，通過血瓊脂平皿培養(yǎng)時，(48～72)h僅形成(0.5～1)mm的不溶血小菌落，臨床樣本中又存在大量多種微生物，使分離培養(yǎng)非常困難。長爪沙鼠和樹鼩還屬于新型實驗動物，長爪沙鼠雖已經經過了一定程度的凈化，但本研究中所用沙鼠為普通級別，所含微生物種類依然很豐富。樹鼩樣品為野生馴化種群，其較高的感染率應為其野生狀態(tài)的直接體現(xiàn)。日本學者Kimura同樣根據(jù)16 S rRNA建立了普通PCR方法，在褐家鼠(R.norvegicus)和黑鼠(R.rattus)中檢出念珠狀鏈桿菌的陽性率分別為92%(61/66)和58%(30/52)，而在SPF及大鼠(Wistar，SD)中則未檢測出該菌污染［18］。

念珠狀鏈桿菌作為實驗動物微生物質量檢測中必要時檢測的病原菌，在日常檢測中往往會被忽視。本研究發(fā)現(xiàn)該菌作為一種重要的人獸共患病原，在實驗動物中感染的風險依然較高。經過對標準菌株和823份動物呼吸道樣本的驗證和檢測，所建立的熒光定量PCR方法具有良好的特異性、敏感性和穩(wěn)定性，能夠滿足快速檢測念珠狀鏈桿菌的要求。

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