狗棗獼猴桃多酚對(duì)S180荷瘤小鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究

左麗麗，富校軼，王振宇，王舒然，*，張　嵐，劉　敏（.吉林醫(yī)藥學(xué)院，公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林303；.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱50090）

狗棗獼猴桃多酚對(duì)S180荷瘤小鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究

左麗麗1，富校軼1，王振宇2，王舒然1，*，張嵐1，劉敏1
（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院，公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林132013；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090）

摘要：觀察狗棗獼猴桃多酚的體內(nèi)抗腫瘤作用。小鼠腋下注射S180實(shí)體瘤模型，建立荷瘤小鼠模型，然后灌胃狗棗獼猴桃多酚，連續(xù)灌胃10 d，觀察荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)狀況及對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響。狗棗獼猴桃多酚具有明顯的抗腫瘤作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且延長(zhǎng)荷瘤小鼠的存活時(shí)間；能夠顯著增強(qiáng)脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖能力。食用狗棗獼猴桃具有一定的抗腫瘤作用，其作用機(jī)制可能是通過增強(qiáng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能來實(shí)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞：狗棗獼猴桃多酚；S180實(shí)體瘤；抗腫瘤

獼猴桃多酚是自然界中分布最多的活性成分之一，主要存在于獼猴桃果實(shí)和葉子中，具有很好的抗氧化活性[1-2]。研究表明，許多植物多酚對(duì)癌細(xì)胞的增殖都有一定的抑制作用[3-4]，而狗棗獼猴桃多酚（Actinidia kolomikta polyphenols，AKP）由于其優(yōu)越的抗腫瘤作用而成為現(xiàn)在最受關(guān)注的多酚類物質(zhì)之一。一些癌癥發(fā)病的危險(xiǎn)性與獼猴桃制品的攝入量呈負(fù)相關(guān)性，食用狗棗獼猴桃能夠降低癌癥的風(fēng)險(xiǎn)性，特別是對(duì)肺癌和宮頸癌細(xì)胞具有很好的抑制作用[5]。本試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行抗腫瘤方面的實(shí)驗(yàn)研究，為開發(fā)其防癌、抗癌的應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑和儀器

狗棗獼猴桃多酚（AKP）：哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院生物化工實(shí)驗(yàn)室制備；環(huán)磷酰胺分析純：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基：美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；二甲基亞砜（DMSO）：Sigma公司；酶標(biāo)儀：Biocell公司；96孔培養(yǎng)板；培養(yǎng)瓶（Costar）。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性昆明小鼠，體重（25±2）g，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院。

1.2方法

1.2.1建立荷瘤小鼠模型

小鼠正常進(jìn)食給水，保持溫度在25℃左右，濕度為45%，實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)一周，使其適應(yīng)環(huán)境。無菌條件下，抽取S180荷瘤小鼠的腹水0.2 mL，快速接種到健康昆明小鼠的腹腔內(nèi)。一周后，挑選腹水生長(zhǎng)狀況良好、腹腔體積膨大形成正壓力，并且沒有潰破的S180荷瘤小鼠，使用75%乙醇對(duì)小鼠的皮膚進(jìn)行表面消毒，無菌條件下抽取荷瘤小鼠腹水，使用生理鹽水將其稀釋并最終調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106cells/mL，選取健康昆明小鼠，分別于小鼠右前肢腋下皮下接種上述S180細(xì)胞懸液0.2 mL[6]，接種120只，即得S180荷瘤小鼠模型。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及灌胃方法

接種次日，將S180荷瘤小鼠隨機(jī)分成五組（模型組、陽(yáng)性對(duì)照組-環(huán)磷酰胺、狗棗獼猴桃多酚低、中、高劑量組），每組20只，以及未接種的空白對(duì)照組，分別對(duì)其進(jìn)行編號(hào)，試驗(yàn)組低、中、高劑量組小鼠分別灌胃不同濃度的狗棗獼猴桃多酚（50、100、150 mg/kg·d），環(huán)磷酰胺注射劑量為20 mg/kg·d，連續(xù)給藥10 d，模型組和空白對(duì)照組分別灌胃生理鹽水，于第11 d從各組中隨機(jī)抽取10只小鼠，脫臼處死，迅速剝離小鼠的腫瘤和脾臟、胸腺組織，稱重并測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，各組余下的小鼠繼續(xù)觀察直至死亡，記錄其存活天數(shù)。

1.2.3荷瘤小鼠免疫指數(shù)測(cè)定

小鼠處死后迅速摘取胸腺、脾臟，用生理鹽水反復(fù)沖洗血污，并用濾紙吸干水分，稱取胸腺和脾臟的重量，按照下述公式計(jì)算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)[7]：臟器指數(shù)=器官重量（mg）/小鼠體重（g）

1.2.4狗棗獼猴桃多酚對(duì)S180實(shí)體瘤的抑制率

小鼠處死后于右前肢腋窩位置迅速剝離瘤塊，剔除周圍的結(jié)締組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分后并稱取瘤重，使用下述公式計(jì)算腫瘤抑制率[8]：

腫瘤抑制率/%=（模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100

1.2.5T淋巴細(xì)胞增殖功能測(cè)定

無菌條件下，取小鼠脾臟組織，制備脾臟單細(xì)胞懸浮液[9]，按照MTT顏色反應(yīng)法測(cè)定脾淋巴細(xì)胞增殖功能。

2　結(jié)果

2.1AKP對(duì)荷瘤小鼠外觀特征及生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的影響

小鼠接種S180實(shí)體瘤細(xì)胞次日，觀察其外觀、飲食及活動(dòng)均正常；給藥第3天后，接種S180實(shí)體瘤的模型組小鼠一般狀況變差，逐漸出現(xiàn)精神萎靡，行動(dòng)遲緩，毛發(fā)雜亂干澀等現(xiàn)象，如表1所示。

表1　S180荷瘤小鼠的外觀特征Table 1　Appearance characteristics of S180 solid tumor in mice

而同期灌胃AKP的小鼠以及腹腔注射環(huán)磷酰胺的小鼠一般狀況明顯優(yōu)于模型組小鼠。接種三或四日后可觸及皮下有沙粒樣腫塊，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)腫瘤逐漸增大，與模型組相比，AKP和環(huán)磷酰胺藥物組腫瘤增長(zhǎng)緩慢，與此同時(shí)，給藥組小鼠的飲食、活動(dòng)及體重逐漸恢復(fù)正常，而模型組小鼠表現(xiàn)出豎毛現(xiàn)象，飲食及活動(dòng)量減少，瘤塊體積逐漸增大，體重有所降低。在剝離腫瘤時(shí)，模型組小鼠的瘤塊體積較大，有的浸潤(rùn)到皮膚和胸骨，界限不清，不易剝離，而藥物組實(shí)體瘤體積較小，界限清晰易剝離。

模型組小鼠接種S180實(shí)體瘤后，第3、4天可在右前側(cè)腋部皮下觸及腫瘤，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)腫塊面積明顯變大，且與皮膚深部組織發(fā)生粘連。接種S180實(shí)體瘤后所有小鼠的皮下均有腫瘤組織生長(zhǎng)，第5天～第8天時(shí)腫瘤生長(zhǎng)速度最快，其中模型組實(shí)體瘤體積最大，給藥組隨著劑量的增加實(shí)體瘤受到不同程度的抑制，AKP低劑量組對(duì)實(shí)體瘤的增長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，AKP中劑量和高劑量組對(duì)S180實(shí)體瘤具有極顯著的抑制作用，并成明顯的劑量依賴關(guān)系，而環(huán)磷酰胺對(duì)實(shí)體瘤的的抑制效果最佳。

2.2AKP對(duì)S180實(shí)體瘤生長(zhǎng)的抑制作用

狗棗獼猴桃多酚各劑量組和環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤的抑制作用如圖1所示，與模型組相比，肉眼觀察到給藥組實(shí)體瘤的體積明顯減少。根據(jù)瘤重計(jì)算AKP對(duì)其的抑制率如表2所示。

結(jié)果表明AKP各劑量組對(duì)S180實(shí)體瘤的增長(zhǎng)均具有較為明顯的抑制作用（P<0.05或P<0.01），低、中、高劑量的AKP對(duì)實(shí)體瘤的抑制率分別為20.91%，38.17%和44.27%，并呈明顯的劑量依賴關(guān)系，陽(yáng)性對(duì)照組環(huán)磷酰胺對(duì)S180實(shí)體瘤的抑制率為66.96%。不同濃度的狗棗獼猴桃多酚對(duì)S180實(shí)體瘤的生長(zhǎng)抑制作用，組間存在顯著性的差異，尤其是高劑量AKP的抑制效果最佳，這種抑制作用與陽(yáng)性對(duì)照相比略弱一些。試驗(yàn)結(jié)果表明攝取一定劑量的AKP對(duì)S180實(shí)體瘤的生長(zhǎng)具有很好的抑制作用，進(jìn)一步揭示了AKP在體內(nèi)具有顯著的抗腫瘤作用。

2.3AKP對(duì)S180荷瘤小鼠存活時(shí)間的影響

藥物對(duì)S180實(shí)體瘤小鼠的存活時(shí)間影響如表3所示。

圖1　AKP對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤的影響Fig.1　Effect of AKP on S180 solid tumor in mice

表2　狗棗獼猴桃多酚對(duì)S180實(shí)體瘤的抑制作用Table 2　Inhibition ratio of AKP on S180 solid tumor in mice

表3　狗棗獼猴桃多酚對(duì)S180荷瘤鼠存活時(shí)間的影響Table 3　Effect of AKP on survival time S180 solid tumor in mice

進(jìn)一步分析狗棗獼猴桃多酚對(duì)S180實(shí)體瘤小鼠生存率的影響。結(jié)果顯示模型組小鼠由于受到實(shí)體瘤的影響使得機(jī)體免疫力顯著降低，導(dǎo)致其生存時(shí)間明顯縮短。給藥組與模型組相比，AKP低、中、高各劑量組能夠顯著的提高S180小鼠的存活時(shí)間，提高率分別為17.56%，21.37%，26.01%，而陽(yáng)性對(duì)照組環(huán)磷酰胺對(duì)S180荷瘤小鼠的存活率提高了48.09%，這表明狗棗獼猴桃多酚各劑量組能夠顯著抑制S180實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，可以有效的提高荷瘤小鼠的生存時(shí)間。

2.4AKP對(duì)荷瘤鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

AKP對(duì)荷瘤鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響見表4。

表4　狗棗獼猴桃多酚對(duì)S180荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響Table 4　Effect of AKP on liver and spleen index of S180 solid tunor in mice

免疫系統(tǒng)擔(dān)負(fù)著免疫防御、免疫監(jiān)視以及免疫自穩(wěn)等多種功能，免疫器官是機(jī)體執(zhí)行免疫功能的重要場(chǎng)所，在此產(chǎn)生免疫反應(yīng)[10]。胸腺是機(jī)體內(nèi)的中樞免疫器官，能夠產(chǎn)生大量T淋巴細(xì)胞，分泌胸腺激素，參與細(xì)胞免疫是其主要的功能；而脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官，與體液免疫關(guān)系非常密切。免疫器官的重量與動(dòng)物的免疫功能密切相關(guān)，免疫器官的臟器指數(shù)是衡量機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)。表4結(jié)果顯示不同劑量的狗棗獼猴桃多酚和環(huán)磷酰胺能夠顯著提高S180荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，并呈濃度劑量依賴關(guān)系，尤其以AKP高劑量組最明顯，這表明狗棗獼猴桃多酚能夠通過保護(hù)小鼠的臟器指數(shù)有效提高S180荷瘤小鼠的免疫功能。

2.5AKP對(duì)荷瘤鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

狗棗獼猴桃多酚對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響結(jié)果如表5所示。

與正常對(duì)照組相比，模型組脾淋巴細(xì)胞的增殖能力急劇降低（P<0.01），而不同劑量的給藥組脾淋巴細(xì)胞的增殖率顯著高于S180實(shí)體瘤模型組，并表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系，這表明一定濃度的狗棗獼猴桃多酚能夠促進(jìn)機(jī)體脾淋巴細(xì)胞的增殖，具有很好的免疫增強(qiáng)作用，AKP抑制S180實(shí)體瘤的增殖與其提高免疫力具有一定的相關(guān)性。在機(jī)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞經(jīng)常發(fā)生并存在，正是由于機(jī)體本身具有免疫系統(tǒng)的監(jiān)控功能才會(huì)使其幸免于難。因此，從一定意義上講，免疫系統(tǒng)可以識(shí)別腫瘤細(xì)胞并對(duì)其作出反應(yīng)來清除癌變的細(xì)胞。這就引發(fā)人們通過激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)抗腫瘤目的的嘗試。加深入的研究。

表5　AKP對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖影響Table 5　Effect of AKP on proliferation of lymphocyte

3　結(jié)論

近年來的研究表明，狗棗獼猴桃多酚具有多種食療保健作用，如增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，提高細(xì)胞的免疫功能，新陳代謝以及提高DNA的修復(fù)功能等。本實(shí)驗(yàn)研究了狗棗獼猴桃多酚的體內(nèi)抗腫瘤作用，結(jié)果表明狗棗獼猴桃多酚能夠顯著地抑制S180實(shí)體瘤的增長(zhǎng)，延長(zhǎng)機(jī)體的存活時(shí)間，提高機(jī)體的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，增強(qiáng)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力，有效提高機(jī)體的免疫能力。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明狗棗獼猴桃多酚可能具有一定的抗腫瘤作用，有必要對(duì)其進(jìn)行更

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.008

收稿日期：2015-03-24

作者簡(jiǎn)介：左麗麗（1982—），女（漢），講師，博士，主要從事天然產(chǎn)物分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定與功能研究。

*通信作者：王舒然（1968—），男（漢），教授，博士，主要從事慢性病的膳食預(yù)防和控制。

Experimental Studies of Actinidia Kolomikta Polyphenols in Inhibiting Tumor Growth in S180 Bearing Mice

ZUO Li-li1，F(xiàn)U Xiao-yi1，WANG Zhen-yu2，WANG Shu-ran1，*，ZHANG Lan1，LIU Min1
（1.School of Public Health，Jilin Medical College，Jilin 132013，Jilin，China；2.School of Food Science and
Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，Heilongjiang，China）

Abstract：To observe the inhibition effect of Actinidia kolomikta polyphenols on tumor in mice.S180 solid tumor-bearing mice were used animal model.The mice were given Actinidia kolomikta polyphenols by oral for 10 days.The effects of Actinidia kolomikta on tumor weight，spleen lymphocyte proliferation and organ indexes were examined.Actinidia kolomikta polyphenols could markedly decrease tumor weight，inhibit the growth of cancer cell，prolong the survival days.Actinidia kolomikta polyphenols could promote spleen lymphocyte proliferation.Actinidia kolomikta polyphenols could inhibit the growth of S-180 solid tumor.The anti-tumor effect may be related to its immune function.

Key words：Actinidia kolomikta polyphenols；S180 solid tumor；anti-tumor