纖維素酶輔助醇提荔枝核黃酮的工藝研究

姚莉，戴遠威，何敏，吳麗，韓淑琴（.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)系，廣東廣州50000；.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州50000；3.中山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東中山58400）

纖維素酶輔助醇提荔枝核黃酮的工藝研究

姚莉1，戴遠威1，何敏1，吳麗2，韓淑琴3，*
（1.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)系，廣東廣州510000；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510000；3.中山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東中山528400）

摘要：以荔枝核為原料，研究纖維素酶輔助醇提荔枝核黃酮的工藝?？疾烀柑砑恿?、酶解時間、醇提溫度、醇提時間4個單因素對荔枝核黃酮提取率的影響，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇四因素三水平進行正交試驗優(yōu)化工藝條件。結(jié)果表明，纖維素酶輔助醇提荔枝核黃酮的最優(yōu)工藝條件為酶添加量5 000 U/g、酶解時間90 min、醇提溫度70℃、醇提時間2.5 h，在此條件下，荔枝黃酮提取率可達5.64%，比乙醇回流法提取提高了74.07%。

關(guān)鍵詞：荔枝核黃酮；纖維素酶；醇提

荔枝為嶺南佳果，果肉細嫩爽甜，富含多種有機酸、維生素及大量游離絲氨酸和精氨酸，果實營養(yǎng)價值高[1-2]。荔枝核是荔枝的干燥成熟種子，含有多種活性物質(zhì)[3]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認為，荔枝核具有降血糖、降血脂等多種生理功效[4-5]，開發(fā)前景看好。鮮荔枝核的含量約為荔枝產(chǎn)量的20%～25%，除少量用于中藥外，大部分棄之未用[6]，造成了資源的浪費。

生物酶解提取技術(shù)是根據(jù)植物細胞壁的結(jié)構(gòu)組成，利用酶反應(yīng)具有的高度專一性等特點，選擇相應(yīng)的酶，對原料進行酶解預(yù)處理，破壞細胞壁的結(jié)構(gòu)，使有效成分充分暴露出來，在傳統(tǒng)的溶劑提取方法的基礎(chǔ)上，使得更多有效成分溶解、混懸于溶劑中，從而提高提取率[7]。目前，已有研究利用乙醇回流提取[8-9]、熱浸提取[8]、微波輔助提取[8]、超聲輔助提取荔枝核黃酮[10]，但是生物酶解預(yù)處理技術(shù)在荔枝核黃酮提取的應(yīng)用卻鮮有報道。本文研究纖維素酶解輔助醇提荔枝核黃酮的工藝，考察各因素對黃酮提取率的影響，并通過正交優(yōu)化實驗得出最優(yōu)工藝條件，為荔枝核中黃酮成分的提取提供一種新途徑。

1　材料和方法

1.1材料與設(shè)備

荔枝：市售；纖維素酶：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；蘆丁標準品：廣州齊云生物科技有限公司；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無水醋酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、冰醋酸：均為分析純。

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州奧華儀器有限公司；PL203電子精密天平：特勒-托克多儀器（上海）有限公司；SHZ-III型循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；UV-5100紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1工藝流程

荔枝→取核→50℃干燥粉碎→粉碎（60目篩）→加30 mL緩沖液→酶解預(yù)處理→滅酶→乙醇回流提取→測定提取液黃酮含量

1.2.2蘆丁標準曲線的繪制

參照文獻[11]的方法作修改：精確稱取蘆丁標準品0.020 g，加30%乙醇30 mL，超聲溶解后定容于50 mL容量瓶中，得濃度為400 μg/mL的標準品溶液。精密稱取上述蘆丁標準品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5分別至25 mL具塞試管中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，靜置6min后，加入10%硝酸溶液0.3mL，搖勻，靜置6 min，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4.0 mL，用30%乙醇溶液定容，搖勻，靜置15 min后，于510 nm波長處測定吸光度。以蘆丁標準品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得出線性回歸方程為Y=0.011 6X+0.010 8，R2=0.997 5，式中：Y為吸光度，X為總黃酮濃度（μg/mL），蘆丁質(zhì)量濃度在0～40 μg/mL范圍內(nèi)吸光度的線性關(guān)系良好。

1.2.3荔枝核黃酮提取率的測定

稱取2 g左右荔枝核粉，加入30 mL乙酸—乙酸鈉緩沖溶液，再加入一定量的纖維素酶，在pH 4.5、酶解溫度55℃的條件下，酶解一定時間，90℃滅酶10 min后，加入50 mL 90%乙醇溶液在一定的溫度下回流提取一定時間，過濾，用90%的乙醇溶液洗滌濾渣，合并濾液，pH調(diào)至7.0，用30%乙醇定容至250mL，取2 mL樣液測定總黃酮提取率，提取率計算公式如式（1）所示。

式中：Y為測定液的吸光度；m為荔枝核質(zhì)量，g。

1.3單因素對荔枝核黃酮提取率的影響

在酶解時間為60 min，醇提溫度為70℃，醇提時間為1.5 h的條件下，選定纖維素酶添加量為2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g，探究酶添加量對黃酮提取率的影響；在酶添加量為4 000 U/g，醇提溫度為70℃，醇提時間為1.5 h的條件下，選定酶解時間為30、45、60、75、90 min，探究酶解時間對黃酮提取率的影響；在酶添加量為4 000 U/g，酶解時間為60 min，醇提時間為1.5 h的條件下，選定醇提溫度為40、50、60、70、80℃，探究醇提溫度對黃酮提取率的影響；在酶添加量為4 000 U/g，酶解時間為60 min，醇提溫度為70℃的條件下，選定醇提時間為0.5、1、1.5、2、2.5，探究醇提時間對黃酮提取率的影響。

1.4正交優(yōu)化試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗，選取酶添加量（A）、酶解時間（B）、醇提溫度（C）、醇提時間（D）進行四因素三水平正交優(yōu)化試驗，各因素水平見表1。

表1　正交試驗因素與水平設(shè)計Table 1　Orthogonal test design

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1纖維素酶添加量對荔枝核黃酮提取率的影響

在其他條件不變的情況下，選定纖維素酶添加量為2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g，探究酶添加量對黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1　纖維素酶添加量對荔枝核黃酮提取率的影響Fig.1　The effect of enzymatic content on extraction rates of litchi seed flavonoids

由圖1可知，當(dāng)纖維素酶添加量為1 000 U/g～5 000 U/g時，荔枝核黃酮提取率顯著增加，而纖維素酶添加量大于5 000 U/g，黃酮提取率反而降低。原因可能是在一定的酶解時間內(nèi)，隨著酶添加量的增加，纖維素酶能與更多的底物反應(yīng)，并加快酶解反應(yīng)速率，使黃酮物質(zhì)充分暴露出來，有利于下一步的醇提；當(dāng)酶達到一定濃度時，受底物數(shù)量限制，酶促反應(yīng)速率將不再增加，此時進一步增加酶量，反而會引起酶之間的競爭，甚至出現(xiàn)抑制作用。因此，根據(jù)試驗結(jié)果，纖維素酶的添加量在4 000 U/g～6 000 U/g為宜。

2.1.2酶解時間對荔枝核黃酮提取率的影響

在其他條件不變的情況下，選定酶解時間為30、45、60、75、90 min，探究酶解時間對黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2　酶解時間對荔枝核黃酮提取率的影響Fig.2　The effects of enzymolysis time on extraction rates of litchi seed flavonoids

由圖2可知，荔枝核黃酮提取率隨著酶解時間的延長而增加，這是因為隨著酶解時間的延長，酶與底物的充分反應(yīng)，荔枝核細胞壁的結(jié)構(gòu)在纖維素酶的作用下降解，使得黃酮物質(zhì)更容易溶解、擴散于乙醇溶液中，從而提高黃酮的提取率。但是酶解時間大于75 min，黃酮提取率增加較緩慢，可能是由于酶的作用已完全，此時再增加酶解時間，反而會影響提取效率，因此，酶解時間在60 min～90 min為宜。

2.1.3醇提溫度對荔枝核黃酮提取率的影響

在其他條件不變的情況下，選定醇提溫度為為40、50、60、70、80℃，探究醇提溫度對黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3　醇提溫度對荔枝核黃酮提取率的影響Fig.3　The effects of extraction temperature on extraction rates of litchi seed flavonoids

由圖3看出，醇提溫度在70℃以下時，溫度的升高有利于黃酮提取率的增加。原因在于溫度升高利于分子運動速度加快，從而在一定的時間內(nèi)，加快有效成分的擴散速度，使得更多的黃酮物質(zhì)溶出。但溫度過高，使乙醇蒸發(fā)加快，導(dǎo)致溶液中乙醇濃度降低，不利于荔枝核黃酮的溶出[12]，同時，溶液的損失也在一定程度上導(dǎo)致溶液中黃酮濃度的增加，細胞內(nèi)外的滲透壓減少也會影響荔枝核黃酮的提取。另外，醇提溫度的上升也會產(chǎn)生耗能增加的問題。因此，考慮黃酮提取率和提取耗能，醇提溫度在60℃～70℃為宜。

2.1.4醇提時間對荔枝核黃酮提取率的影響

在其他條件不變的情況下，選定醇提時間為0.5、1、1.5、2、2.5 h，探究醇提時間對黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　醇提時間對荔枝核黃酮提取率的影響Fig.4　The effects of extraction time on extraction rates of litchi seed flavonoids

由圖4看出，隨著醇提時間的增加，荔枝核黃酮提取率呈兩個階段變化：第一階段是醇提時間為0.5 h～1.5 h，此階段黃酮提取率顯著增加；第二階段是醇提時間為1.5 h～2.5 h，黃酮提取率增加較為平緩。這是由于在醇提初始階段，由于黃酮類物質(zhì)在乙醇溶液中濃度很低，荔枝核細胞內(nèi)外的滲透壓大，黃酮物質(zhì)可迅速溶出，導(dǎo)致黃酮提取率明顯增加；但是隨著提取時間的延長，溶液趨于飽和，黃酮物質(zhì)溶解度降低，從而提取率變化緩慢[13]。因此，為了獲得較高的黃酮提取率，醇提時間在1.5 h～2.5 h為宜。

2.2正交試驗結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗，選取酶添加量（A）、酶解時間（B）、醇提溫度（C）、醇提時間（D）進行四因素三水平正交優(yōu)化試驗，結(jié)果見表2。

表2　正交試驗結(jié)果Table 2　The result of orthogonal experiment

續(xù)表2 正交試驗結(jié)果Continue table 2　The result of orthogonal experiment

表2極差分析結(jié)果表明，各因素對黃酮提取率的影響大小次序為D>A>C>B，即醇提時間＞酶添加量＞醇提溫度＞酶解時間。由正交優(yōu)化結(jié)果得到的最優(yōu)工藝組合為A2B3C3D3，即酶添加量為5 000 U/g、酶解時間為90 min、醇提溫度為70℃、醇提時間為2.5 h。

2.3驗證試驗

由于優(yōu)選的工藝未包括在正交設(shè)計表的試驗中，故對其進行驗證試驗。稱取2g荔枝核粉，按最優(yōu)工藝條件A2B3C3D3，進行3次平行試驗，分別測定黃酮提取率，計算得出黃酮的平均提取率為5.64%，均高于單因素試驗組和正交試驗組，表明優(yōu)化得到的工藝條件合理。

2.4纖維素酶輔助醇提法與乙醇回流提取法比較

稱取2 g左右荔枝核粉，加入30 mL乙酸—乙酸鈉緩沖溶液，加入50 mL 90%乙醇溶液70℃溫度下回流提取2.5 h，過濾，用90%的乙醇溶液洗滌濾渣，合并濾液并定容至250 mL，取2 mL樣液測定黃酮提取率，并與纖維素酶輔助醇提最優(yōu)工藝條件下得到黃酮提取率比較，結(jié)果如圖5所示。

圖5　不同提取方法對荔枝核黃酮提取率的影響Fig.5　The effects of different extraction technology on extraction rates of litchi seed flavonoids

由圖5可知，乙醇回流2.5 h后，荔枝核黃酮提取率為3.85%；而經(jīng)過纖維素酶對荔枝核預(yù)處理90 min再乙醇回流提取，黃酮提取率提高了74.07%，說明纖維素酶預(yù)處理能有效提高荔枝核黃酮提取率。

3　結(jié)論與展望

通過單因素和正交優(yōu)化試驗，得出纖維素酶輔助醇提荔枝核黃酮的最優(yōu)工藝條件為酶添加5 000 U/g、酶解時間90 min、醇提溫度70℃、醇提時間2.5 h，在此條件下，荔枝黃酮提取率可達5.64%，比乙醇回流提取提高了74.07%，說明纖維素酶預(yù)處理能有效提高荔枝核黃酮提取率，纖維素酶在荔枝核中黃酮成分的提取具有一定的發(fā)展前景。

近年來，酶法提取技術(shù)作為一種溫和、高效的提取技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用，酶能使植物材料降解形成疏散結(jié)構(gòu)，具有提取效率高、成本低廉等優(yōu)點。同時，由于酶法提取可以溫和的條件下進行，所得的產(chǎn)物純度、穩(wěn)定性及活性都較高，且安全無污染[14]。本文研究了纖維素酶解輔助醇提荔枝核黃酮的工藝，并得出最優(yōu)的工藝參數(shù)，而纖維素酶預(yù)處理對產(chǎn)物純度、穩(wěn)定性及活性的影響需做進一步的研究。

參考文獻：

[1]江蘇醫(yī)學(xué)院.中藥大詞典[M].上海:上?？萍汲霭嫔?1997:235-480

[2]賈敏,黃麗,韋保耀,等.荔枝汁產(chǎn)品中有機酸、糖類和游離氨基酸的對比分析[J].食品科技,2010,35(10):95-99

[3] 屠鵬飛,羅青,鄭俊華.荔枝核的化學(xué)成分研究[J].中草藥,2002,33 (4):300-303

[4]潘競鏘,劉惠純,劉廣南,等.荔枝核降血糖、調(diào)血脂和抗氧化的實驗研究[J].廣東藥學(xué),1999,9(1):47-49.

[5]Liu Yaguang.Pharmaceutical composition containing a safe extracts of fruits and vegetables for treating and preventing of diabetes[P]. United States Patent:4985248,1991-01-15

[6]劉朝霞,錢敏,陳海光.荔枝核的加工研究進展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011,38(3):87-89

[7] 任偉,呂高輝,王廣.酶解技術(shù)在食品和制藥工業(yè)中的應(yīng)用[J].山西化工,2007,27(4):55-57

[8]湯建萍,周春山,涂秋云,等.荔枝核黃酮類化合物的提取工藝研究[J].應(yīng)用化工,2007,36(2):109-113

[9]孫哲浩,李寶珍,趙謀明,等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化荔枝核總黃酮提取工藝的研究[J].食品與機械,2006,22(1):30-32

[10]林大專,惠春,孫全樂,等.超聲法提取荔枝核黃酮類化合物的工藝研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2013,32(9):1221-1223

[11]孔繁晟,賁永光,孫愛群,等.超聲法與連續(xù)回流法提取黃芪總黃酮的工藝對比研究[J].中國藥房,2010,21(19):1752-1754

[12]陳向明,徐濤,查甫本.山核桃外果皮黃酮提取與純化[J].農(nóng)業(yè)機械學(xué)報,2011,42(12):177-181

[13]謝藍華,杜冰,葉瓊娟,等.正交試驗優(yōu)化酶法提取黃芪總黃酮工藝[J].包裝與食品機械,2013,31(3):7-12

[14]蔡小燕,王超,葉宋,等.酶在植物活性成分提取中的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)機械,2012,30(10):90-93

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.018

收稿日期：2014-07-04

作者簡介：姚莉（1977—），女（漢），講師/質(zhì)量工程師，碩士，研究方向：食品加工、食品科學(xué)方面應(yīng)用研究。

*通信作者：韓淑琴，講師，研究方向：天然產(chǎn)物有效成分提取與應(yīng)用。

Study on Process of Cellulase Assisted Ethanol Extraction of Litchi Seed Flavonoids

YAO Li1，DAI Yuan-wei1，HE Min1，WU Li2，HAN Shu-qin3，*
（1.Department of Biotechnology，Guangdong Vocational College of Science and Trade，Guangzhou 510000，Guangdong，China；2.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510000，Guangdong，China；3.Zhongshan Vocational and Technical College，Zhongshan 528400，Guangdong，China）

Abstract：Used litchi seed as material，the process of cellulase assisted ethanol extraction of litchi seed flavonoids was on studied.The effects of enzymatic content，enzymolysis time，extraction temperature and extraction time on extraction rates of litchi seed flavonoids were explored，and four factors and three levels of orthogonal test was experimented based on single-factor test.The result showed that the optimal conditions of process of cellulase assisted ethanol extraction of Litchi seed flavonoids were enzymatic content of 5 000 U/g，enzymolysis time of 90 min，extraction temperature of 70℃ and extraction time of 2.5 h.Under these conditions，the extraction rates of litchi seed flavonoids could be up to 5.64%，which was 74.07%higher than that by ethanol extraction.

Key words：litchi seed flavonoids；cellulose；ethanol extraction