超聲波預(yù)處理葵花籽粕蛋白制備抗氧化多肽的研究

董聰，李芳，王琳，羅豐收，朱俊雅，孔令明，*（.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊83005；.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊8300）

超聲波預(yù)處理葵花籽粕蛋白制備抗氧化多肽的研究

董聰1，李芳2，王琳1，羅豐收1，朱俊雅1，孔令明1，*
（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830021）

摘要：以葵花籽粕蛋白粉為原料，利用超聲波對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶為酶制劑對(duì)葵花籽粕蛋白進(jìn)行酶解，以抗氧化性為指標(biāo)，通過單因素及響應(yīng)面法對(duì)預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，獲取最佳預(yù)處理工藝。結(jié)果表明，葵花籽粕蛋白質(zhì)的超聲波最佳預(yù)處理工藝為：超聲波時(shí)間25 min、超聲波功率187.5 W、超聲波溫度40℃。在此條件下，葵花籽粕多肽對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）和羥基自由基（·OH）清除能力分別為67.11%和52.47%。

關(guān)鍵詞：超聲波預(yù)處理；葵花籽粕蛋白；多肽；抗氧化活性

新疆地處歐亞大陸中部，光照資源豐富，干旱少雨，晝夜溫差大，適宜向日葵的生長(zhǎng)同時(shí)是向日葵的主產(chǎn)區(qū)，目前全疆每年向日葵的種植面積在10萬畝左右，年產(chǎn)葵花籽25.39萬t[1]。

葵花籽粕是葵花籽制油的副產(chǎn)物，葵花籽粕營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，含29%～43%的優(yōu)質(zhì)的植物蛋白[2]，且氨基酸組成均衡?？ㄗ哑芍羞€含有大量的類脂、碳水化合物、還原糖、灰分[3]及大量的鈣、磷和煙酸[4]等。

葵花籽粕蛋白質(zhì)具有很好的蛋白特性，經(jīng)過適當(dāng)酶解可制備生物活性多肽如抗氧化劑、ACE抑制劑、抗疲勞劑抗癌劑及抗菌劑等[5]，已有的研究表明，葵花籽粕多肽具有較高的抗氧化劑抗高血壓活性[6]?？寡趸钚噪囊蚓哂休^強(qiáng)的抗氧化活性和很高的安全性，故可作為具有抗氧化作用的食品添加劑或直接作為保健食品應(yīng)用于食品工業(yè)[7]。但目前，葵花籽加工僅限于榨油和制作炒貨食品，而葵花籽粕多用作牲畜飼料或者直接拋棄，這不僅造成了極大的資源浪費(fèi)而且還污染環(huán)境，對(duì)于其的精深加工后的經(jīng)濟(jì)價(jià)值值得人們重視。

超聲波具有空化作用，可以在瞬間產(chǎn)生較強(qiáng)的機(jī)械剪切力，使蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，促使其親水基團(tuán)暴露出來的更多[8]，有利于蛋白質(zhì)底物和酶結(jié)合，提高酶解效率。本研究對(duì)超聲波預(yù)處理雙酶酶解葵花籽粕蛋白制備抗氧化活性多肽工藝進(jìn)行優(yōu)化，從而提高葵花籽粕利用率及創(chuàng)造更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。研究成果將為葵花籽綜合利用及開發(fā)功能性食品提供科學(xué)數(shù)據(jù)和參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

葵花籽粕蛋白：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制；堿性蛋白酶及木瓜蛋白酶：購于南寧龐博生物工程有限公司；無水乙醇、鄰菲羅啉、鄰苯三酚：購于天津市化學(xué)試劑三廠；氫氧化鈉：購于天津市福星化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、過氧化氫30%，等：購于天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

全數(shù)字超聲波發(fā)生器：武漢嘉鵬電子有限公司（額定功率250 W）；電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；雷磁PHS-3C：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；AL204-1C型電子天平：上海梅特勒托利多儀器有限公司；TD5A-WS臺(tái)式低速離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TU-1810紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1超聲波輔助酶解葵花籽粕蛋白工藝流程

葵花籽粕蛋白→懸浮液→超聲波預(yù)處理→調(diào)pH→水浴酶解→滅酶→離心→取上清液→測(cè)定抗氧化能力

1.3.2抗氧化能力的測(cè)定

·OH清除能力的測(cè)定：采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[9]；O2-·清除能力的測(cè)定：采用鄰苯三酚方法[6]。

1.3.3單因素試驗(yàn)

選用堿性蛋白酶（酶活力為2.265×10-3kat/g）及木瓜蛋白酶（酶活力1.674×10-3kat/g）為酶制劑，在時(shí)間為190 min、pH為7.6、復(fù)合酶（堿性蛋白酶：木瓜蛋白酶）比例為2.5∶1（質(zhì)量比）、[E]/[S]為2%、底物濃度為2%、溫度為50℃的酶解條件下，以抗氧化能力為指標(biāo)，確定超聲波預(yù)處理葵花籽粕蛋白的最佳功率[10]、溫度[11]、時(shí)間[12]條件。

1.3.4響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在超聲波功率（X1）、超聲波時(shí)間（X2）、超聲波溫度（X3）單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以羥基自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率為指標(biāo)，以超聲波功率、超聲波時(shí)間、超聲波溫度為試驗(yàn)因素，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)超聲波輔助復(fù)合酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。因素水平表如表1所示。

表1　試驗(yàn)因素水平表Table 1　Test factor and level table

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1超聲波預(yù)處理功率對(duì)葵花籽粕多肽抗氧化能力的影響

在超聲波溫度為40℃、超聲波時(shí)間為20 min、超聲波功率分別為0、62.5、125、187.5、250 W的條件下，葵花籽粕多肽抗氧化能力如圖1所示。

由圖可知超聲波功率在0%～75%范圍內(nèi)時(shí)，抗氧化能力隨超聲波功率的增加而增大，在超聲波功率為187.5 W時(shí)，超氧陰離子自由基和羥基自由基清除能力均達(dá)到最大值，分別為57.71%和39.38%。超聲波功率大于187.5 W后，抗氧化能力并沒有隨功率的增加而增大，可能是因?yàn)楣β瘦^大致使蛋白質(zhì)變性，故確定超聲波功率為187.5 W。

2.1.2超聲波預(yù)處理溫度對(duì)葵花籽粕多肽抗氧化能力的影響

在超聲波時(shí)間為20 min、超聲波功率為125 W、超聲波溫度分別為30、35、40、45、50℃的條件下，葵花籽粕多肽抗氧化能力如圖2所示。

由圖2可知超聲波功溫度在30℃～40℃范圍內(nèi)時(shí)，抗氧化能力隨超聲波溫度的增加而增大，在超聲波溫度為40℃時(shí)，超氧陰離子自由基和羥基自由基清除能力均達(dá)到最大值，分別為61.63%和44.67%。超聲波溫度高于40℃后，抗氧化能力隨超聲波溫度的增加而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說明超聲波輔助酶解的溫度不一定和水浴酶解的溫度一致，故確定超聲波溫度為40℃。

2.1.3超聲波預(yù)處理時(shí)間對(duì)葵花籽粕多肽抗氧化能力的影響

圖2　超聲波溫度對(duì)抗氧化能力的影響Fig.2　Ultrasonic temperature effects the anti-oxidation

在超聲波功率為125 W、超聲波溫度為40℃、超聲波時(shí)間分別為10、15、20、25、30 min的條件下，葵花籽粕多肽抗氧化能力如圖3所示。

圖3　超聲波時(shí)間對(duì)抗氧化能力的影響Fig.3　Ultrasonic time effects the anti-oxidation

由上圖可知超聲波功時(shí)間在10 min～25 min范圍內(nèi)時(shí)，抗氧化能力隨超聲波時(shí)間的增加而逐漸增大，在超聲波時(shí)間達(dá)到25 min時(shí)，超氧陰離子自由基和羥基自由基清除能力均達(dá)到最大值，分別為58.07%和35.62%。超聲波時(shí)間大于25 min后，抗氧化能力隨超聲波時(shí)間的增加而逐漸下降，可能是由于經(jīng)過超聲波的輔助水解使葵花籽粕蛋白質(zhì)高度壓縮、緊密的結(jié)構(gòu)斷開，長(zhǎng)鏈打開，故抗氧化能力在較短時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，由此確定超聲波時(shí)間為25 min。

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，如表2。

以超聲波功率、時(shí)間、溫度為響應(yīng)變量，以超氧陰離子自由基清除率為響應(yīng)值對(duì)表2進(jìn)行方差分析，模型顯著性及數(shù)據(jù)結(jié)果見表3。

表2　根據(jù)Design-erpert8.0設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2　The test scheme and results according to design-erpery 8.0 design response surface

表3　模型方差分析及模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3　Model significant inspection and regression model analysis of variance

以超聲波功率、時(shí)間、溫度為響應(yīng)變量，以羥基自由基清除率為響應(yīng)值對(duì)表2進(jìn)行方差分析，模型顯著性及數(shù)據(jù)結(jié)果見表4。

表4　模型方差分析及模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4　Model significant inspection and regression model analysis of variance

利用Design-erpert8.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，以超聲波時(shí)間、超聲波功率、超聲波溫度為響應(yīng)變量，以超氧陰離子自由基清除率（Y1）和羥基自由基的清除率（Y2）為響應(yīng)值的回歸方程為：

由表3回歸方差分析可知，模型R2=0.998 6說明回歸方程有意義，F(xiàn)模型=496.08（P<0.000 1），模型極顯著，失擬項(xiàng)F=0.020（P<0.05）結(jié)果不顯著；由表4回歸方差分析可知，模型R2=0.999 4說明回歸方程有意義，F(xiàn)模型=1 853.55（P<0.000 1），模型極顯著，失擬項(xiàng)F= 0.92（P<0.05）結(jié)果不顯著，表3和表4說明試驗(yàn)結(jié)果誤差較小擬合度較小，能較好的反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果。

通過軟件分析結(jié)果得出，葵花籽粕多肽對(duì)自由基清除率最佳條件為：超聲波時(shí)間25 min、超聲波功率187.5 W、超聲波溫度40℃。在此條件下，葵花籽粕多肽對(duì)超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除率分別為67.11%和52.47%。響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果見圖4～圖7。

圖4　時(shí)間和溫度對(duì)O·清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.4　Response surface of time and temperature on the scavenging capacity of O·

圖5　功率和溫度對(duì)O·清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.5　Response surface of power and temperature on the scavenging capacity of O·

圖6　時(shí)間和功率對(duì)·OH清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.6　Response surface of time and power on the scavenging capacity of·OH

圖7　功率和溫度對(duì)·OH清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.7　Response surface of power and temperature on the scavenging capacity of·OH

3　結(jié)論

本文采用超聲波預(yù)處理葵花籽粕蛋白后，再對(duì)其進(jìn)行酶解得到葵花籽粕抗氧化活性多肽。比較葵花籽粕多肽對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率，確定其最佳預(yù)處理?xiàng)l件。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)曲面法獲得最優(yōu)預(yù)處理工藝為：超聲波時(shí)間25 min、超聲波功率187.5 W、超聲波溫度40℃。在此條件下，葵花籽粕多肽液對(duì)超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除率分別為67.11%和52.47%。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.003

收稿日期：2014-07-24

基金項(xiàng)目：自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目“葵花籽粕功能多肽高效制備技術(shù)研究與產(chǎn)品開發(fā)”（2013911070）

作者簡(jiǎn)介：董聰（1990—），女（漢），碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及綜合利用。

*通信作者：孔令明（1976—），男（漢），副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及綜合利用研究。

Ultrasonic Pretreat Protein of Sunflower Meal Preparation Antioxidant Peptides

DONG Cong1，LI Fang2，WANG Lin1，LUO Feng-shou1，ZHU Jun-ya1，KONG Ling-ming1，*
（1.College of Food and Pharmaceutics，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，Xinjiang，China；2.Xinjiang Institute of Light Industry Technology，Urumqi 830021，Xinjiang，China）

Abstract：Sunflower meal protein powder used as raw material，used ultrasonic to pretreated it，made alkaline protease and papain as enzyme preparation on sunflower meal protein hydrolysis.Optimized pretreatm process conditions by univariate and response surface method with antioxidant activity as an index，to obtain the best pretreatment processes.The results showed that the best sunflower meal protein ultrasonic pretreatment process：ultrasonic time 25 min，ultrasonic power187.5 W，ultrasonic temperature of 40℃.Under this condition，the scavenging of sunflower meal peptides on superoxide anion radical（O2-·）and hydroxyl radicals（·OH）were 67.11%and 52.47%.

Key words：ultrasonic pretreat；sunflower meal protein；peptides；antioxidant activity