納米金比色法快速檢測蔬菜中毒死蜱方法的研究

貝　峰，聶　梅，艾仕云，趙成新（.泰安出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東泰安7000；.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院，山東泰安7000）

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納米金比色法快速檢測蔬菜中毒死蜱方法的研究

貝峰1，聶梅1，艾仕云2，趙成新1
（1.泰安出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東泰安271000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院，山東泰安271000）

摘要：建立了一種快速檢測蔬菜中毒死蜱殘留量的比色方法。該方法基于鑭（III）功能化納米金與含氧酸根的配位，加入毒死蜱引起功能化的金納米粒子發(fā)生聚集，使溶液出現(xiàn)紅色到藍(lán)色的變化，可以通過用肉眼觀察顏色或者用紫外分光光度法檢測其吸光度的變化來檢測毒死蜱的含量。毒死蜱濃度在5×10-10mol/L～5×10-7mol/L范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.1nmol/L（S/N=3）。該方法操作簡單、成本低、比色明顯，可用于蔬菜中毒死蜱殘留的現(xiàn)場檢測。

關(guān)鍵詞：金納米粒子；毒死蜱；比色法

毒死蜱（chlorpyrifos）俗稱樂斯苯，屬中等毒性有機(jī)磷殺蟲劑，目前已被日本禁止在菠菜中使用，我國也在新國標(biāo)限量中對其做出了禁用的嚴(yán)格規(guī)定。目前國內(nèi)外對蔬菜中毒死蜱殘留的檢測技術(shù)[1-5]主要有酶抑制法、色譜法、免疫分析法等，這些檢測方法雖能檢測樣品中毒死蜱的含量，卻存在費(fèi)時、費(fèi)力、成本高，儀器設(shè)備昂貴及操作人員專業(yè)要求高等缺陷，難以適應(yīng)現(xiàn)場的實(shí)時快速檢測。

將鑭（III）固定在納米金粒子表面，形成鑭功能化納米金（AuNPs-La），鑭（III）與有機(jī)磷農(nóng)藥中的含氧基團(tuán)結(jié)合，形成不溶于水的納米金、鑭（III）和有機(jī)磷農(nóng)藥的復(fù)合物（AuNPs-La-毒死蜱）使溶液由酒紅色變?yōu)樗{(lán)色，可通過顏色變化來可視化檢測有機(jī)磷農(nóng)藥，或通過分光光度法定量有機(jī)磷農(nóng)藥。

1　材料與方法

1.1材料

UV2450分光光度計(jì)：日本島津；旋渦混合器：廣州IKA公司；KQ-100DA型超聲波：昆山市超聲儀器有限公司；氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O Au）、檸檬酸鈉：上?；瘜W(xué)試劑有限公司；毒死蜱：德國Dr公司；氯化鑭（含量≥45%）：上海山浦化工有限公司；試驗(yàn)用水均為二次重蒸水，試劑均為分析純。

菠菜、綠花菜樣品均取自泰安出口蔬菜種植基地。

1.2氯化鑭功能化納米金（AuNPs-La）的制備[6-9]

用檸檬酸三鈉還原法制備納米金顆粒（AuNPs），溶液顏色為紅色，在520 nm左右有一吸收峰；取一定量的AuNPs溶液，用ABS溶液稀釋到其原濃度的1/4，然后加入一定量的氯化鑭溶液，使其濃度為0.10mmol/L，搖勻，靜置。

1.3試驗(yàn)條件的優(yōu)化

1.3.1氯化鑭濃度的影響

取一定量的AuNPs溶液，用ABS溶液稀釋到其原濃度的1/4，加入濃度為1.5 mmol/L的氯化鈉溶液，加入氯化鑭溶液，使其濃度依次為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 mmol/L，搖勻，再加入最終濃度為5×10-9mol/L的毒死蜱。搖勻，靜置，觀察溶液顏色的變化，5 min測定紫外可見吸收光譜。

1.3.2pH的影響

取一定量的AuNPs溶液，依次用pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的ABS緩沖溶液稀釋到原濃度的1/4，加入濃度為0.10mmol/L的氯化鑭溶液，1.5mmol/L的氯化鈉溶液，混勻，加入濃度為5×10-9mol/L毒死蜱，搖勻，靜置，觀察溶液顏色的變化，4 min測定紫外可見吸收光譜。

1.3.3氯化鈉濃度的影響

取一定量的AuNPs-La溶液，加入濃度為1.0、1.5、2.0 mmol/L氯化鈉溶液，混勻，分別加入濃度為5×10-9、5×10-8、5×10-7mol/L的毒死蜱，搖勻，靜置，觀察現(xiàn)象。

1.4實(shí)際樣品的處理

先將蔬菜樣品粉碎，向10 g樣品中加入一定濃度水平的毒死蜱溶液，放置4 h，用50 mL無水乙醇超聲萃取30 min，4 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液至15 mL離心管中，加入600 mg C18，600 mg PSA，400 mg PC，渦流混合1 min，4 000 r/min離心5 min，精確量取一定體積該上清液，用構(gòu)建的比色法檢測。

1.5吸光度差值的計(jì)算

文中所用的吸光度差值通過以下公式進(jìn)行計(jì)算：ΔA=A0-Ai，式中：A0是指鑭功能化納米金溶液的吸光度，Ai是指加入毒死蜱后鑭功能化納米金溶液的吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1試驗(yàn)原理

試驗(yàn)將鑭（III）固定在納米金粒子表面，形成鑭功能化納米金（AuNPs-La），利用將鑭（III）與有機(jī)磷農(nóng)藥中的含氧基團(tuán)結(jié)合，形成不溶于水的納米金-鑭-有機(jī)磷農(nóng)藥（AuNPs-La-毒死蜱）復(fù)合物，顏色由酒紅色逐漸變成藍(lán)色。因此可用此性質(zhì)檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的含量。

2.2氯化鑭功能化納米金（AuNPs-La）與納米金（AuNPs）的紫外可見吸收光譜

納米金溶液（AuNPs）與氯化鑭功能化納米金溶液（AuNPs-La）顏色的對比見圖1，AuNPs與AuNPs-La的紫外可見吸收光譜見圖2。

圖1　AuNPs（a）與AuNPs-La（b）顏色的對比Fig.1　Color contrast of AuNPs（a）and AuNPs-La（b）

圖2　AuNPs與AuNPs-La的紫外可見吸收光譜Fig.2　UV-vis absorption spectra of AuNPs and AuNPs-La

由圖1可知，兩種溶液顏色基本相同；由圖2可知，AuNPs-La仍在522 nm處有最大吸收峰，峰值也未發(fā)生明顯的變化。

2.3試驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1氯化鑭濃度的確定

不同氯化鑭濃度引起的溶液顏色變化見圖3。

圖3　氯化鑭濃度對納米金顏色的影響Fig.3　Color of AuNPs with different concentration of lanthanum chloride

當(dāng)氯化鑭的濃度不高于0.10 mmol/L時，溶液顏色依然為酒紅色，而當(dāng)氯化鑭濃度大于0.10 mmol/L時，溶液則變?yōu)闇\紫色。不同氯化鑭濃度對溶液紫外吸收的影響曲線見圖4。

圖4　氯化鑭濃度對納米金紫外吸收的影響Fig.4　A of AuNPs with different concentration of lanthanum chloride

當(dāng)氯化鑭濃度高于0.10mmol/L時，ΔA的值才隨氯化鑭濃度的升高依次增加。因此選擇氯化鑭的最佳濃度為0.10 mmol/L。

2.3.2pH對試驗(yàn)的影響

溶液pH對吸光度差的影響見圖5，pH=5.0時，吸光度差值最大，因此選擇pH=5.0為最佳pH。

圖5　溶液pH對吸光度差值的影響Fig.5　A of AuNPs-La with different pH

2.3.3氯化鈉濃度對試驗(yàn)的影響

氯化鈉濃度對試驗(yàn)體系的影響見圖6。

圖6　氯化鈉濃度對試驗(yàn)的影響Fig.6　AuNPs with different concentrations of chlorpyrifos and sodium chloride

氯化鈉濃度為1.0 mmol/L時，毒死蜱的濃度由高到低變化時，溶液顏色變化不明顯；氯化鈉濃度為2.0 mmol/L時，加入毒死蜱濃度極低（5×10-9mol/L）時，溶液就發(fā)生聚沉，變?yōu)樗{(lán)色；氯化鈉濃度為1.5 mmol/L時，毒死蜱濃度大于5×10-7mol/L，溶液顏色瞬間發(fā)生由紅色向藍(lán)色的轉(zhuǎn)變，毒死蜱濃度為5×10-8mol/L，3 min后顏色由紅色變成紫色。因此選擇氯化鈉的最佳濃度為1.5 mmol/L。

2.4毒死蜱聚集的動力學(xué)研究

室溫條件下，不同毒死蜱濃度引起AuNPs-La的吸光度差變化的動力學(xué)研究見圖7。

圖7　不同毒死蜱濃度下AuNPs-La吸光度差（ΔA）隨時間的變化Fig.7　Plot of ΔA versus time at different concentrations of chlorpyrifos

隨時間延長，吸光差ΔA逐漸增加，增加趨勢趨于平緩的時間分別為：低濃度下（5×10-9mol/L），約120s，中濃度下（5×10-8mol/L），約90 s，高濃度下（5×10-7mol/L），約60 s，說明隨著毒死蜱濃度的增加，吸光差達(dá)到最大值所用的時間逐漸縮短。在開始的1 min內(nèi)吸光比迅速增加，隨后增加緩慢，幾乎在均在2 min內(nèi)曲線最終趨于平緩，因此可迅速、靈敏的檢測毒死蜱的含量。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

不同毒死蜱濃度下AuNPs-La的顏色比對見圖8。

圖8　不同毒死蜱濃度下AuNPs-La的顏色變化Fig.8　Color of AuNPs with different concentrations of chlorpyrifos

隨著毒死蜱濃度的增加，顏色依此由酒紅色變成淺紫色最后變成藍(lán)色。不同毒死蜱濃度下AuNPs-La的紫外可見吸收（UV-vis）圖譜見圖9。

隨著毒死蜱濃度的增加，AuNPs-La的吸光度依此降低，降低的幅度依此增大。吸光度差（ΔA）與毒死蜱濃度的線性關(guān)系見圖10。

在5×10-10mol/L～5×10-7mol/L（R=0.996）濃度范圍內(nèi)，ΔA與毒死蜱濃度的對數(shù)成線性關(guān)系。根據(jù)信噪比S/N=3計(jì)算得出毒死蜱的檢出限為1×10-10mol/L。

2.6回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

試驗(yàn)在菠菜和綠花菜樣品基質(zhì)中加入了5.0、50.0 和500.0 nmol/L 3個濃度水平的毒死蜱，每個濃度水平6個平行，按照1.4方法進(jìn)行前處理后，進(jìn)行回收檢測，結(jié)果見表1。

圖1　0　吸光度差與毒死蜱濃度的線性關(guān)系Fig.10　The linear relationship between the ΔA and the concentration of chlorpyrifos

可以看出，毒死蜱檢測濃度和加入濃度較為一致，6次平行樣品結(jié)果的平均回收率在94.2%到109.6%之間，說明構(gòu)建的光比色傳感器可以用于實(shí)際樣品的檢測。

表1　實(shí)際樣品回收試驗(yàn)結(jié)果Table 1　Recovery studies of chlorpyrifos in vegetable（n=3）

3　結(jié)論

我們建立了一種能快速、靈敏的檢測蔬菜中毒死蜱殘留的納米金比色分析方法。該方法基于有機(jī)磷農(nóng)藥能誘使鑭功能化的納米金由分散態(tài)（酒紅色）向聚集態(tài)（藍(lán)色）的轉(zhuǎn)化。整個試驗(yàn)分析包括樣品的處理只需15 min左右，檢出限為1×10-10mol/L，該方法能安全、快速、現(xiàn)場實(shí)時檢測蔬菜中的毒死蜱含量，不僅能肉眼進(jìn)行定性檢測，還可以借助分光光度計(jì)進(jìn)行定量檢測。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.031

收稿日期：2014-10-22

基金項(xiàng)目：山東檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目（SK201357）

作者簡介：貝峰（1971—），男（漢），高級工程師，碩士研究生，研究方向：食品安全分析。

Gold Nanoparticles-based Colorimetric Assay for Rapid Detection of Chlorpyrifos in Vegetable

BEI Feng1，NIE Mei1，AI Shi-yun2，ZHAO Cheng-xin1
（1.Tai'an Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tai'an 271000，Shandong，China；2.College of Chemistry and Material Science，Shandong Agricultural University，Tai'an 271000，Shandong，China）

Abstract：A gold nanoparticles-based colorimetric assay for rapid detection of chlorpyrifos in vegetable was developed.Based on the coordination effect of the oxygen-containing groups and lanthanum（III）functionalized gold nanoparticles，chlorpyrifos could induce the aggregation of lanthanum functionalized gold nanoparticles，thereby resulting in red-to-blue color change.So the concentration of chlorpyrifos could be determined by monitoring with the naked eye or a UV-vis spectrometer.The absorption difference of the assay exhibited a linear correlation to chlorpyrifos concentration in the range from 5×10-10mol/L to 5×10-7mol/L with a limit of detection of 0.1 nmol/L（S/N=3）.The merits（such as simplicity，low cost and visual colorimetry）make the proposed method for on-site screening of chlorpyrifos in vegetable.

Key words：gold nanoparticles；chlorpyrifos；colorimetry