抗TNF-α/抗ED-B雙特異抗體在酵母中的分泌表達(dá)與活性分析

胡雪平，謝冕，李路軍，蔣思婧，劉夢(mèng)元

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抗TNF-α/抗ED-B雙特異抗體在酵母中的分泌表達(dá)與活性分析

胡雪平1,2，謝冕1,2，李路軍1,2，蔣思婧1,2，劉夢(mèng)元1,2

1湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院感染與免疫研究中心，湖北武漢 430062 2 湖北綠色生物資源轉(zhuǎn)換協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430062

賦予抗TNF-α 單鏈抗體片段(TNF-scFv) 對(duì)炎癥組織的特異性，用一段來(lái)自人清蛋白 (HSA) 的柔性連接肽在基因水平上連接TNF-scFv和抗B型纖維連接蛋白(B-FN) 的額外域B (ED-B) 的scFv L19，構(gòu)建了抗TNF-α/抗ED-B單鏈雙特異抗體BsDb，其中B-FN為炎癥組織中特異表達(dá)的抗原。BsDb在畢赤酵母中獲得了分泌表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鑒定和純化制備后，進(jìn)行了功能分析。結(jié)果表明，BsDb保留了其親本抗體TNF-scFv和L19對(duì)抗原的免疫反應(yīng)性，能夠同時(shí)結(jié)合TNF-α和ED-B，并中和TNF-α的生理作用。而且，BsDb對(duì)抗原的親和力及中和能力與大腸桿菌包涵體來(lái)源的親本抗體相比顯著增強(qiáng)。在小鼠佐劑型關(guān)節(jié)炎(AIA) 模型中，BsDb能選擇性地積累和保留于小鼠的炎癥關(guān)節(jié)，并快速?gòu)难獫{中清除。說(shuō)明BsDb兼?zhèn)溲装Y組織的特異性和正常組織的低毒性，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及其他慢性炎癥性疾病的治療上具有較大潛力。

雙特異抗體，腫瘤壞死因子α，纖維連接蛋白，額外域B，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎

目前，有4個(gè)TNF-α的單克隆抗體批準(zhǔn)上市用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 (Rheumatoid arthritis，RA) 和其他自身免疫性疾病的治療[1]。但是，這些單抗缺乏針對(duì)炎癥組織的特異性，系統(tǒng)給藥只有極少部分被炎癥組織攝取[2-3]。而且，較長(zhǎng)的血漿半衰期使其過(guò)于暴露于正常組織，帶來(lái)較大的副作用[4-5]。因此，研究組織特異性強(qiáng)，提高抗TNF-α生物制劑的安全性，對(duì)RA及其他自身免疫病治療顯得尤為重要。組織特異性的藥物運(yùn)載體系是解決這個(gè)問(wèn)題的理想途徑，因?yàn)樗梢允顾幬镞x擇性地積累于靶組織，降低藥物在正常組織中的暴露。小分子的抗體片段保留了完整抗體結(jié)合抗原的特異性，同時(shí)具備半衰期短、組織穿透力強(qiáng)、對(duì)正常組織毒副作用小等特點(diǎn)，是構(gòu)建組織特異性藥物運(yùn)載體系的良好工具[6]。

纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N) 是胞外基質(zhì)的重要組成成分，F(xiàn)N前體mRNA的選擇性拼接，可產(chǎn)生不同類型的FN[7]。保留額外域B (Extra domain B，ED-B) 的FN (B-FN) 在正常成人組織中不表達(dá)，但在胎組織和腫瘤組織中豐富表達(dá)[8-10]。B-FN作為血管生成的標(biāo)志物[11]，其單抗BC1和scFv L19已廣泛用于抗惡性腫瘤血管生成的靶向治療[12-13]。研究表明，B-FN同樣特異性高表達(dá)于RA的炎癥滑膜和部分其他自身免疫病的炎癥組織中[14-15]。L19融合的IL-10和TNFRⅡ能選擇性積累于小鼠的炎癥關(guān)節(jié)，對(duì)小鼠關(guān)節(jié)炎的療效顯著高于單獨(dú)的IL-10或TNFRⅡ[16-17]。L19在臨床上還用于RA的影像學(xué)診斷[18]。這些資料表明，B-FN是靶向治療RA和其他自身免疫病的優(yōu)良抗原。

我們構(gòu)建了抗TNF-α的單鏈抗體 (TNF-scFv) 及其多價(jià)抗體[19-21]，證實(shí)了TNF-scFv及其多價(jià)抗體對(duì)小鼠關(guān)節(jié)炎模型具有顯著的治療作用[20]。為了進(jìn)一步提高其炎癥組織的特異性，減少副作用，用一段選自人清蛋白 (HSA) 的連接肽在基因水平上連接抗TNF-α的單鏈抗體 (TNF-scFv) 和抗ED-B的單鏈抗體L19，構(gòu)建了抗TNF-α/抗ED-B的雙特異抗體BsDb。其目的是利用L19特異性結(jié)合B-FN的作用將TNF-scFv靶向?qū)隦A或其他自身免疫病的炎癥組織中，構(gòu)建一種高效低毒的新型生物治療劑。我們實(shí)現(xiàn)了BsDb在畢赤酵母中的分泌表達(dá)，并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株

質(zhì)粒載體pMD18T/TNF-scFv及質(zhì)粒載體pMD18T/L19 (EMBL Accession No. AJ006113) 由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建并保存。大腸桿菌Top10購(gòu)自天根生化科技 (北京) 有限公司 (Tiangen Biotech)，用于分子克隆和質(zhì)粒的保存；畢赤酵母宿主細(xì)胞GS115 (His4) 和整合型的酵母表達(dá)載體pHBM905B由湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馬立新教授惠贈(zèng)；小鼠成纖維細(xì)胞L929購(gòu)自美國(guó)ATCC，實(shí)驗(yàn)室保存，需要時(shí)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(FBS，Hyclone) RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。

1.2 試劑

人TNF-α購(gòu)自Peprotech公司；人B-FN購(gòu)自Speed Biosystem；FITC標(biāo)記的抗組氨酸標(biāo)簽 (His tag) 單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、pfu DNA多聚酶以及DNA回收試劑盒購(gòu)自大連寶生物 (TaKaRa)；Ni-NTA親和層析凝膠購(gòu)自Pharmacia；放線菌素D購(gòu)自Fluka化學(xué)公司。單鏈抗體TNF-scFv、L19、CD3-scFv均由大腸桿菌表達(dá)的包涵體蛋白制備[19-21]，并由本實(shí)驗(yàn)室保存，在羧基末端帶有His tag。弗氏完全佐劑購(gòu)自Sigma公司。昆明小鼠 (18±2) g，雄性，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并用標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒類動(dòng)物飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，所有相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的操作嚴(yán)格按照國(guó)家科技部發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》(1988年11月14日2號(hào)令) 進(jìn)行。

1.3 雙特異抗體BsDb表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

以質(zhì)粒pMD18T/TNF-scFv及質(zhì)粒pMD18T/L19為模板，分別擴(kuò)增TNF-scFv及L19的編碼片段。擴(kuò)增的引物如表1所示。構(gòu)建的流程如圖1所示。融合蛋白的表達(dá)載體pHBM905B/BsDb，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，進(jìn)行質(zhì)粒的擴(kuò)增，提取質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，確保片段的正確連接和序列正確。重組質(zhì)粒pHBM905B/BsDb用Ⅰ酶切線性化，電轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞GS115 (His4)，轉(zhuǎn)化子首先在不含組氨酸的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，陽(yáng)性克隆進(jìn)一步提取細(xì)胞基因組DNA，并經(jīng)PCR進(jìn)行鑒定 (引物P1和P4)。上述各個(gè)基因片段的擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1min，循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min。

1.4 BsDb的表達(dá)與鑒定

挑選鑒定的陽(yáng)性重組子，接種25 mL BMGY培養(yǎng)基 (100 mmol/L磷酸二氫鉀， pH 6.0，1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，4×10–5% () 生物素，1% () 甘油)，30 ℃搖動(dòng)培養(yǎng)至600為6?8，3 000×離心10 min收集細(xì)胞，重懸于250 mL BMMY培養(yǎng)基 (BMGY培養(yǎng)基中用0.5%甲醇替代甘油)，繼續(xù)培養(yǎng)120 h，每隔12 h加入終濃度為0.5%甲醇保持連續(xù)的誘導(dǎo)表達(dá)，5 000×離心，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清， SDS-PAGE (12%) 檢測(cè)表達(dá)情況。將凝膠上的蛋白條帶電轉(zhuǎn)至0.45 μm硝酸纖維膜 (美國(guó)Pall Gelman)，取出膜，于含5%的脫脂牛奶的1×PBS緩沖液 (pH 7.4) 中4 ℃封閉過(guò)夜，1×PBS洗膜3次，每次3 min；將膜浸泡于含HRP標(biāo)記抗組氨酸標(biāo)簽的單抗 (1：1 000稀釋) 的1×PBS緩沖液(pH 7.4) 中，37 ℃孵育2 h，1×PBS洗膜3次，每次3 min；加入DAB顯色劑，待顯色到理想的程度，自來(lái)水沖洗，終止反應(yīng)。

1.5 BsDb純化制備

向250 mL上述表達(dá)上清中緩慢加入等體積的100%飽和的硫酸銨 (pH 7.0)，置于4 ℃過(guò)夜，緩慢搖動(dòng)，以確保蛋白充分沉淀，于4 ℃、 10 000×離心30 min收集沉淀蛋白質(zhì)并重懸于20 mL 1×PBS中，裝入透析袋，置于1 000 mL緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)， 150 mmol/L NaCl) 中，4 ℃攪拌透析24 h，每隔6 h更換一次透析緩沖液，充分去除蛋白中的硫酸銨和其他雜質(zhì)。隨后，蛋白質(zhì)通過(guò)固定化的Ni2+親和層析純化 (IMAC)。上述透析后的蛋白溶液上樣于經(jīng)過(guò)10倍柱體積的透析緩沖液平衡的Ni2+親和層析柱，流速0.5 mL/min；上樣后，用緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)， 500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑) 洗滌至基線，流速為1 mL/min，充分去除非結(jié)合的蛋白質(zhì)；最后蛋白質(zhì)用緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，150 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑) 洗脫，流速為1 mL/min，收集蛋白質(zhì)峰，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，并用100倍體積的1×PBS緩沖液(pH 7.4) 進(jìn)行透析12 h，每4 h更換一次緩沖液，充分去除蛋白中的咪唑及其他無(wú)機(jī)離子。透析后的蛋白質(zhì)14 000×離心20 min，0.22 μm濾膜過(guò)濾，以去除少量的蛋白沉淀物和潛在的微生物，Bradford定量，冷凍干燥備用。

1.6 抗原結(jié)合ELISA

100 ng/孔TNF-α及100 ng/孔B-FN分別包被于96孔ELISA板，每孔于100 μL 0.1 mol/L的碳酸鹽緩沖液 (pH 9.6) 中，4 ℃過(guò)夜。PBST洗板2次，用100 μL含5% (/)的脫脂牛奶的1×PBS緩沖液(pH 7.4) 37 ℃封閉2 h。PBST洗板3次，于每孔中加入100 μL不同濃度的BsDb或?qū)φ湛贵w (包涵體來(lái)源的TNF-scFv、L19及CD3-scFv)，每個(gè)抗體濃度做5復(fù)孔，置ELISA板于37 ℃溫箱中孵育1.5 h。PBST洗板3次，于每孔中加入100 μL HRP標(biāo)記的抗His tag單抗 (1∶1 000稀釋)，置ELISA板于37 ℃溫箱中孵育1 h。PBST洗板3次，于每孔中加入100 μL顯色液 (1 mmol/L OPD，0.016% () H2O2)，37 ℃避光孵育10 min，酶標(biāo)儀讀取每孔490 nm處的吸收值。

表1 用于構(gòu)建雙特異抗體BsDb的引物

Note:Ⅰand aⅠrestriction sites (In italics) were introduced to the P1 and P4, respectively, for cloning purpose. The sequence encoding the HSA linker that comprises amino residues 490–513 of HSA was added to 5′ terminal of P3 (In shadow). Primers P2 and P3 have a complementary region of 20 base pairs (Underlined), insuring to perform the overlapping PCR and to covalently link the gene fragments encoding TNF-scFv, HSA linker and L19. A 6 × histidine (His tag) (In bold) coding sequence and a stop codon (In shadow) were introduced into primer P4, giving a translation stop and insuring identification and affinitive purification of BsDb. P1 and P2 is for the amplification of gene encoding TNF-scFv, and P3 and P4 for the amplification of HSA linker-L19 fusion gene.

1.7 抑制TNF-α的細(xì)胞毒作用

EDTA消化收集培養(yǎng)的L929細(xì)胞，用RPMI-1640 (10% FBS) 培養(yǎng)基調(diào)整濃度為2.5×105個(gè)/mL，100 μL/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過(guò)夜。另取一塊96孔培養(yǎng)板，于第3孔到第12孔加入100 μL RPMI-1640 (2% FBS) 培養(yǎng)基倍比稀釋的雙特異抗體BsDb。同樣的方法處理TNF-scFv及CD3-scFv，每種抗體濃度梯度做3復(fù)孔，剩余的孔1和孔2加入100 μL的培養(yǎng)基；于第2孔到12孔加入100 μL RPMI-1640 (2% FBS) 培養(yǎng)基稀釋的TNF-α，至終濃度為1 ng/mL，剩余的孔1加入100 μL的培養(yǎng)基，置37 ℃溫箱中孵育2 h。棄掉第1塊培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，將第2塊培養(yǎng)板的孵育物轉(zhuǎn)移100 μL至第1塊培養(yǎng)板的相應(yīng)孔中，與每孔中補(bǔ)加放線菌素D至終濃度為1 μg/mL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。于每孔中加入10 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)3 h，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗板3次，每次2 min，于每孔中加入50 μL DMSO，搖動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶全部溶解，酶標(biāo)儀閱讀每孔的570 nm的吸收值(570)，如下公式計(jì)算每種抗體對(duì)TNF-α細(xì)胞毒的抑制率 (%)：

抑制率 (%)=[[570,M–570,T]/[570,N–570, T]]× 100%。

其中570,M為加入TNF-α和抗體的3復(fù)孔平均吸收值；570,T為只加TNF-α的3復(fù)孔平均吸收值；570,N為既不加TNF-α又不加抗體的3復(fù)孔的平均吸收值。

為了證實(shí)BsDb在結(jié)合B-FN的情況下，仍然能夠中和TNF-α生理效應(yīng)，對(duì)上述實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了調(diào)整。即在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中首先包被1 μg/孔的B-FN，1×PBS洗板后于每孔中加入不同濃度的BsDb，25 ℃孵育2 h，用1×PBS洗板3次，充分去除未結(jié)合的BsDb，然后于每孔中加入100 μL細(xì)胞懸液，并加入終濃度為1 ng/mL的TNF-α和終濃度為1 μg/mL的放線菌素D，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。后續(xù)抑制作用的分析與上述一致。

1.8 小鼠佐劑型關(guān)節(jié)炎(AIA)的建立

于昆明小鼠尾部皮下注射0.1 mL的弗氏完全佐劑 (結(jié)核桿菌濃度為5 mg/mL)，再于小鼠兩后足趾皮下各注射0.1 mL弗氏完全佐劑。AIA的發(fā)生一般出現(xiàn)在注射后4 d，發(fā)病初期主要出現(xiàn)指關(guān)節(jié)的紅腫，從一個(gè)關(guān)節(jié)累及到多個(gè)關(guān)節(jié)，進(jìn)一步發(fā)展到踝關(guān)節(jié)的腫脹和變形。小鼠關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度通過(guò)對(duì)每只小鼠的后爪評(píng)分的方式進(jìn)行記錄，打分標(biāo)準(zhǔn)為：0=正常；1=紅；2=紅+輕微的腫脹；3=明顯的腫脹；4=關(guān)節(jié)發(fā)生僵直和變性。每只小鼠給出的最高分為8分。

1.9 雙特異抗體BsDb的生物學(xué)分布

40只AIA小鼠隨機(jī)分成8個(gè)實(shí)驗(yàn)組。于每只小鼠尾靜脈注射100 μg FITC標(biāo)記的BsDb (溶于50 μL 1×PBS)，分別于時(shí)間點(diǎn)10 min、30 min、1 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h對(duì)5只AIA小鼠進(jìn)行眼眶采血并處死小鼠。取每只小鼠的炎癥爪子和正常爪子，稱重，快速放入液氮中，研磨成顆?；蛩槠瑢⒔M織轉(zhuǎn)入15 mL的試管，放置與冰上，按1 mL 1×PBS/200 mg 組織的比例重懸組織，充分混勻，用Biospec Tissue-Tearor (Biospec Inc，USA) 進(jìn)行勻漿，于4 ℃、1 000×離心15 min，收集上清，將上清轉(zhuǎn)入1.5 mL的Eppendorf管，15 000×離心15 min，熒光分光光度計(jì) (島津RF-5301PC) 測(cè)定各管的熒光值，并對(duì)照預(yù)先作好的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各管的BsDb的濃度，進(jìn)一步計(jì)算每克組織中的百分注射劑量 (% ID/g)。

1.10 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 BsDb表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定

BsDb表達(dá)載體pHBM905B/BsDb的構(gòu)建流程見圖1。重組質(zhì)粒經(jīng)序列測(cè)定，結(jié)果表明BsDb序列正確并成功插入表達(dá)載體，表達(dá)載體進(jìn)一步轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞GS115 (His4)，轉(zhuǎn)化子通過(guò)陽(yáng)性篩選，并提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，確定pHBM905B/BsDb載體已成功整合到酵母細(xì)胞的基因組，表明穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的重組酵母菌株構(gòu)建成功。HSA連接肽是我們從HSA中遴選的一段具有高度柔性的24肽，連接HSA的Ⅲa結(jié)構(gòu)域的螺旋6和Ⅲb結(jié)構(gòu)域的螺旋1。我們已經(jīng)證實(shí)它具備IgG鉸鏈區(qū)的功能，能夠使兩個(gè)連接的scFv進(jìn)行獨(dú)立折疊和靈活伸展，以有效地結(jié)合各自的抗原。如圖1所示，BsDb基因位于酵母甲醇氧化酶 (AOXⅠ) 啟動(dòng)子控制之下，并與分泌表達(dá)的α-因子信號(hào)肽融合而處于同一閱讀框內(nèi)，這使得融合蛋白在甲醇的誘導(dǎo)下能夠分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中。BsDb用甲醇誘導(dǎo)不同時(shí)間在培養(yǎng)物上清中的表達(dá)情況見圖2，可以看出BsDb表達(dá)量與誘導(dǎo)時(shí)間呈正相關(guān)，最大的表達(dá)量在120 h，大約占整個(gè)酵母培養(yǎng)上清蛋白的30%，其分子量大約為56 kDa，與理論大小一致。Western blotting進(jìn)一步鑒定表明56 kDa蛋白條帶為目的蛋白 (圖2)。融合蛋白通過(guò)固定化的Ni2+親和層析 (IMAC) 一步純化可達(dá)到95%以上的純度 (圖2)，從1L的培養(yǎng)上清中可以常規(guī)的獲得18?20 mg的目的蛋白，濃度在2 mg/mL以上。

圖1 雙特異抗體BsDb表達(dá)載體的構(gòu)建程序

2.2 BsDb與抗原免疫反應(yīng)性

用間接ELISA分析了BsDb與其抗原的免疫反應(yīng)性。如圖3所示，BsDb與其親本抗體TNF-scFv及L19一樣，能夠特異性結(jié)合人TNF-α和B-FN，而對(duì)照抗體CD-scFv對(duì)兩種抗原都沒(méi)有結(jié)合作用。表明BsDb保留了對(duì)兩種抗原的免疫反應(yīng)性，同時(shí)也說(shuō)明HSA連接肽的共價(jià)連接并沒(méi)有影響TNF-scFv和L19的生物學(xué)活性，進(jìn)一步證實(shí)了HSA連接肽能夠充分保證相連的scFv獨(dú)立折疊并有效地結(jié)合各自抗原。我們發(fā)現(xiàn)在同樣條件下，BsDb對(duì)TNF-α及B-FN的結(jié)合信號(hào)都要顯著高于其大腸桿菌包涵體復(fù)性制備的親本抗體TNF-scFv和L19。說(shuō)明通過(guò)酵母的分泌表達(dá)，BsDb對(duì)抗原的親和力有了進(jìn)一步提高。

2.3 BsDb抑制TNF-α的生理作用

TNF-α對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，我們分析了BsDb對(duì)TNF-α細(xì)胞毒性的抑制作用。如圖4所示，BsDb與TNF-scFv一樣，能夠有效抑制TNF-α誘導(dǎo)L929細(xì)胞的凋亡。抑制率與BsDb及TNF-scFv的劑量正相關(guān)。抑制1 ng/mL TNF-α的細(xì)胞毒作用，BsDb 50%抑制的濃度 (IC50) 大約為4 nmol/L，100%抑制的濃度為64 nmol/L。而包涵體來(lái)源的親本抗體TNF-scFv 50%抑制濃度 (IC50) 大約為16 nmol/L，100%抑制濃度為256 nmol/L,說(shuō)明BsDb與TNF-scFv相比對(duì)TNF-α的中和能力也有大幅提升。在生理?xiàng)l件下，BsDb必須特異性結(jié)合炎癥組織中的B-FN，同時(shí)還要中和TNF-α，才能發(fā)揮其靶向治療的作用。為了模擬體內(nèi)的這種情形，我們先在96孔培養(yǎng)板上包被B-FN，然后與BsDb作用，洗去未結(jié)合的BsDb。在這種情況下，只有特異性B-FN的BsDb才能保留在培養(yǎng)板上并抑制TNF-α的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，即使BsDb與B-FN結(jié)合，仍能中和TNF-α的細(xì)胞毒性。相反，如果用大量游離的B-FN與BsDb一起孵育以抑制BsDb與板上包被的B-FN結(jié)合，則不能觀察到對(duì)TNF-α的細(xì)胞毒性的抑制作用。說(shuō)明BsDb具有可同時(shí)結(jié)合兩種抗原并能中和TNF-α的生理活性。

圖2 雙特異抗體BsDb的表達(dá)、鑒定與純化

圖3 BsDb抗原結(jié)合的ELISA分析

圖4 BsDb抑制TNF-α的細(xì)胞毒作用

2.4 BsDb的生物分布

在注射弗氏完全佐劑后的第10天，小鼠關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分平均達(dá)到6左右，我們對(duì)BsDb的血漿清除速率和炎癥關(guān)節(jié)的靶向性進(jìn)行了分析。BsDb在AIA小鼠血漿和爪子中的分布動(dòng)力學(xué)如圖5所示，注射后10 min，血漿中BsDb每克組織百分注射劑量 (%ID/g) 為 (21.2±1.0)，并迅速降低，4 h為 (2.2±0.4)，24 h幾乎全部從血漿中清除。通過(guò)GraphPad Prism 4.0的單相指數(shù)消除進(jìn)行曲線擬合，計(jì)算出BsDb的血漿半衰期 (t1/2β) 為 (0.53±0.05) h。評(píng)價(jià)藥物組織特異性的一個(gè)重要指標(biāo)是藥物在靶組織中的積累和保留作用。BsDb在小鼠炎癥爪子中的迅速積累，并在注射后4 h到達(dá)最高，單個(gè)炎癥爪子最高攝取 (12.5±1.50)% ID/g 的 BsDb，48 h仍然有 (6.23±1.00)% ID/g 的BsDb保留于炎癥爪子中。而BsDb在正常爪子中沒(méi)有積累作用，最大攝取量 (2.98±0.31)% ID/g發(fā)生在注射后30 min，24 h幾乎從正常爪子中完全清除。評(píng)價(jià)藥物靶向性另外一個(gè)重要的指標(biāo)是藥物在靶組織與血漿中的分布比率 (靶血比)。靶血比高說(shuō)明藥物能選擇性積累于靶組織并快速?gòu)难獫{和正常組織中清除。我們計(jì)算了注射后不同時(shí)間點(diǎn)BsDb在炎癥爪子中的% ID/g與血漿中% ID/g的比率，如圖6所示，BsDb的靶血比隨注射時(shí)間快速上升，12 h達(dá)到最大，為103∶1。隨后，積累飽和的BsDb開始緩慢從炎癥爪子清除，因而靶血比呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，24 h為88∶1，48 h仍然為27∶1。這些數(shù)據(jù)表明，BsDb可選擇性積累并較長(zhǎng)時(shí)間停留于AIA小鼠的炎癥關(guān)節(jié)，但能快速?gòu)难獫{和正常組織中清除。

圖5 BsDb在炎癥爪子、正常爪子及血中的分布動(dòng)力學(xué)

圖6 BsDb在炎癥爪子與血中的分布比(靶血比)

3 討論

TNF-α單抗用于臨床已接近20年，療效確切。經(jīng)歷了鼠源單抗、人鼠嵌合單抗、人源單抗的發(fā)展歷程，逐步解決了抗體免疫原性的問(wèn)題，有效地提高了抗體的療效。但其組織特異性是目前亟待解決的問(wèn)題，因?yàn)樗鼘?dǎo)致了不可忽視的副作用，表現(xiàn)為RA患者長(zhǎng)期用藥會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重感染和惡性腫瘤[4-5]。本世紀(jì)初，藥物學(xué)家開始關(guān)注TNF-α小分子抗體片段，因其具有較短的血漿半衰期，快速?gòu)难獫{和正常組織中清除，對(duì)正常組織毒性較小等特點(diǎn)，在一定程度上可克服完整單抗的不足之處，但較短的半衰期又使靶組織對(duì)其攝取量過(guò)低[6]。我們認(rèn)為在TNF-α的小分子抗體片段上共價(jià)連接一個(gè)炎癥組織中特異性表達(dá)抗原的配體分子可以解決上述問(wèn)題。因?yàn)榻柚潴w-抗原的相互作用，可使TNF-α的小分子抗體片段選擇性地積累和保留于炎癥組織，同時(shí)這種小分子抗體片段的融合蛋白缺乏抗體Fc區(qū)而具有較短的半衰期，可快速?gòu)难獫{和正常組織中清除，從而可形成一種高特異性、低毒性的生物治療劑。另外，F(xiàn)N作為炎癥組織中的特異性靶分子，具有特異、穩(wěn)定和豐富等特點(diǎn)。FN是胞外基質(zhì) (ECM) 的重要組成成分，在維持組織正常結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用，為細(xì)胞的分裂、分化和遷移提供一定微環(huán)境[10]。在病理?xiàng)l件下，為了滿足疾病發(fā)展的需要，F(xiàn)N會(huì)發(fā)生重構(gòu)，形成新的異性體。研究表明，在惡性腫瘤組織和慢性炎癥性組織中表達(dá)一種新型的分子B-FN[7,12,14-15]，它是通過(guò)FN前體mRNA在 ED-A、ED-B和IIICS三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行選擇性拼接的產(chǎn)物，其中ED-B可以完全保留或被刪除，ED-B被完全保留的FN為B-FN，這種病理修飾的FN在正常組織是不存在的，但與惡性腫瘤及慢性炎癥的血管形成相關(guān)，是一個(gè)血管形成的標(biāo)志物[11]，其中ED-B在人和哺乳動(dòng)物之間具有100%的同源性，而且表達(dá)穩(wěn)定而豐富，因而是一個(gè)有效靶向惡性腫瘤和慢性炎癥性疾病的優(yōu)良抗原。抗ED-B的單抗BC1和scFv L19廣泛用于藥物載體進(jìn)行抗惡性腫瘤血管形成的靶向治療，并取得了令人振奮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[8,12]。2007年Trachsel等[16]用抗ED-B的scFv L19融合IL-10對(duì)小鼠關(guān)節(jié)模型進(jìn)行治療，證實(shí)L19的融合可以明顯提高IL-10組織特異性和療效，開創(chuàng)了靶向治療RA的先河。隨后有利用L19融合TNFRII 進(jìn)行RA靶向治療的報(bào)道[17]。2011年Kamperidis等[22]通過(guò)噬菌體庫(kù)篩選了一株能特異性結(jié)合RA患者炎癥滑膜微血管上一個(gè)表位的scFv A7，證實(shí)該抗體片段有望成為靶向炎癥關(guān)節(jié)的有效藥物載體。這些資料說(shuō)明，炎癥組織特異性的生物制劑的研究及應(yīng)用代表RA及其他自身免疫病治療藥物的一個(gè)重要發(fā)展方向。

以上研究資料促使我們構(gòu)建了抗TNFα/抗ED-B的雙特異抗體，目的是利用L19特異性結(jié)合B-FN的作用將TNF-scFv靶向?qū)胙装Y部位，提高其療效，降低副作用。體外活性分析表明，該抗體可同時(shí)結(jié)合TNF-α及B-FN，并具有中和TNF-α的生理效應(yīng)，說(shuō)明雙特異抗體構(gòu)建成功。值得注意的是，本研究實(shí)現(xiàn)了BsDb在畢赤酵母中的分泌表達(dá)，這對(duì)我們來(lái)說(shuō)是一次非常有意義的嘗試。我們以前構(gòu)建了多種單鏈抗體片段包括抗TNF-scFv及其多價(jià)抗體、scFv L19以及CD3-scFv等，但是這些抗體片段都無(wú)一例外地在大腸桿菌中形成包涵體[19-21]，往往需要復(fù)雜的復(fù)性制備才能獲得活性蛋白，這是一個(gè)非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作，不利于這些抗體的工業(yè)化生產(chǎn)。而本研究中活性的抗體分子可直接從酵母中分泌到培養(yǎng)基，大大簡(jiǎn)化了分離制備過(guò)程。而且，我們還發(fā)現(xiàn)酵母分泌的BsDb在抗原的親和力和TNF-α中和能力方面與其來(lái)源于大腸桿菌包涵體的親本抗體都有顯著提高。BsDb非常穩(wěn)定，通過(guò)超濾濃縮到2 mg/mL也不會(huì)出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。我們以前對(duì)TNF-scFv及其多價(jià)抗體的包涵體蛋白進(jìn)行復(fù)性時(shí)蛋白濃度超過(guò) 500 μg/mL就會(huì)出現(xiàn)聚集[19-21]。這說(shuō)明酵母分泌表達(dá)的蛋白正確折疊率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于包涵體復(fù)性的蛋白。進(jìn)一步證實(shí)了酵母在重組蛋白生產(chǎn)上的優(yōu)越性，因?yàn)楫叧嘟湍覆粌H具有真核細(xì)胞多種翻譯后的修飾功能，如折疊、二硫鍵形成、糖基化及分泌等[23-24]，而且還能象原核細(xì)胞一樣高密度的培養(yǎng)，與大腸桿菌或其他的真核表達(dá)系統(tǒng)相比，在重組蛋白的生產(chǎn)上具有無(wú)可替代的優(yōu)勢(shì)。因此，本研究同時(shí)也為我們找到了生產(chǎn)該雙特異抗體的有力工具。體內(nèi)生物學(xué)分布研究表明，BsDb可選擇性積累于炎癥關(guān)節(jié)，并在炎癥關(guān)節(jié)中保留較長(zhǎng)時(shí)間，但卻具備較短的血漿半衰期。說(shuō)明BsDb兼?zhèn)溲装Y組織的特異性和正常組織的低毒性，在RA及其他慢性炎癥性疾病的治療上具有較大的潛力。因此，我們的研究達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)。

我們已證實(shí)了TNF-scFv及其多價(jià)抗體尤其是四價(jià)抗體對(duì)CIA小鼠具有較為顯著的療 效[19-21]，相信通過(guò)L19的融合，提高其組織特異性，同時(shí)利用酵母的分泌表達(dá)，提高其生物活性，BsDb在療效上將會(huì)具有更加出色的表現(xiàn)。對(duì)BsDb進(jìn)行全面的藥效學(xué)評(píng)價(jià)，將是我們后期工作的重點(diǎn)。因此，本研究為BsDb臨床前期研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Expression and characterization of a bispecific antibody targeting TNF-α and ED-B containing fibronectin

Xueping Hu1,2, Mian Xie1,2, Lujun Li1,2, Sijing Jiang1,2, and Mengyuan Liu1,2

1,,,430062,,2,430062,,

To enhance the specificity of anti-TNF-α single chain Fv antibody (TNF-scFv) to inflamed site, we constructed a bispecific antibody BsDb that targets TNF-α and ED-B-containing fibronectin (B-FN) by covalently linking TNF-scFv and the anti-ED-B scFv L19 at the gene level via a flexible peptide linker deriving from human serum albumin.BsDb was successfully secreted fromas functional protein, identified by immunoblotting, and purified to homogeneity with affinity chromatography. BsDb retained the immunoreactivity of its original antibodies TNF-scFv and L19, and showed a marked gain in antigen-binding affinity and in TNF-α-neutralizing ability, when compared to TNF-scFv and L19 that were produced in. In the adjuvant-induced arthritis (AIA) mice model, BsDb showed selective accumulation and retention in the inflamed paws but rapid clearance from blood, resulting in high arthritic paw to blood ratios. These data indicate that BsDb is endowed with high specificity to inflamed site and low toxicity to normal tissues and holds great potential forapplication for the targeted therapy of RA and other chronic inflammatory diseases.

bispecific antibody, tumor necrosis factor α, fibronectin, extra domain B, rheumatoid arthritis

July 1, 2014; Accepted: October 29, 2014

Mengyuan Liu. Tel: +86-27-88661237; Fax: +86-27-88666106; E-mail: liumengy@tom.com

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No.30973669/H3004).

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 30973669/H3004) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-11-17

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140350.html