基于SOE-PCR的兩種魚(yú)類hepcidin基因串聯(lián)及其在畢赤酵母中的表達(dá)

李文婧，陶妍，趙冬梅，徐冰冰

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基于SOE-PCR的兩種魚(yú)類hepcidin基因串聯(lián)及其在畢赤酵母中的表達(dá)

李文婧1，陶妍1，趙冬梅1，徐冰冰2

1 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306 2 江蘇八陸生物科技有限公司，江蘇南通 226400

李文婧, 陶妍, 趙冬梅, 等. 基于SOE-PCR的兩種魚(yú)類hepcidin基因串聯(lián)及其在畢赤酵母中的表達(dá). 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(5): 682–691.Li WJ, Tao Y, Zhao DM, et al. Connection of hepcidin genes from two fish species and their expression in Pichiapastoris. Chin J Biotech, 2015, 31(5): 682–691.

Hepcidin抗菌肽是由生物肝臟細(xì)胞表達(dá)的一類具有抗菌作用和鐵代謝調(diào)節(jié)功能的堿性小分子肽，它們?cè)跈C(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮了重要作用，被認(rèn)為是抗生素的理想替代品。通過(guò)重組DNA表達(dá)技術(shù)制備抗菌肽無(wú)疑是一條良好的途徑。為擴(kuò)大hepcidin的抗菌譜和提高其表達(dá)量，通過(guò)SOE-PCR將斑點(diǎn)叉尾鮰hepcidin成熟肽的cDNA“”與尼羅羅非魚(yú)hepcidin成熟肽的cDNA“”進(jìn)行串聯(lián)，并在兩端分別添加RⅠ和Ⅰ酶切位點(diǎn)，以pPIC9K為真核表達(dá)載體，成功構(gòu)建了“pPIC9K-”重組表達(dá)載體；電轉(zhuǎn)化進(jìn)畢赤酵母GS115中，經(jīng)不同濃度G418和選擇性培養(yǎng)基篩選以及對(duì)酵母基因組DNA的PCR鑒定，得到高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子；在30 ℃、以1%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)不同時(shí)間后，經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析，表明發(fā)酵培養(yǎng)72 h時(shí)目的蛋白的表達(dá)量最高，達(dá)77 mg/L。發(fā)酵上清經(jīng)SP-Sepharose陽(yáng)離子交換層析純化后獲得高純度的目的蛋白。抑菌實(shí)驗(yàn)顯示含目的蛋白的發(fā)酵上清和經(jīng)純化后的重組目的蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌都有良好的抑菌效果。本研究結(jié)果為hepcidin抗菌肽的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

抗菌肽，Hepcidin成熟肽，畢赤酵母，SOE-PCR

抗菌肽 (Antimicrobial peptide，AMP) 是生物防御外來(lái)病菌時(shí)，在體內(nèi)迅速合成的具有免疫抗菌活性的肽類物質(zhì)[1]?？咕木哂薪Y(jié)構(gòu)和活性穩(wěn)定、不易產(chǎn)生耐藥性、對(duì)環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)而受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。Hepcidin又稱LEAP-1 (Liver-expressed antimicrobial peptide 1)，是一種主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的堿性小分子抗菌肽，具有廣譜抗菌活性[2]；Nicolas等[3]以老鼠為研究對(duì)象，證明hepcidin對(duì)于調(diào)節(jié)機(jī)體鐵離子代謝平衡發(fā)揮著重要的作用，任何生理狀態(tài)對(duì)體內(nèi)hepcidin水平的改變都將導(dǎo)致機(jī)體鐵水平的變化。Hepcidin由Kruasea等[4]首次從人血清中分離得到，之后Park等[5]從人尿液中也分離得到，隨后在兩棲動(dòng)物和魚(yú)類中亦發(fā)現(xiàn)了類似于hepcidin的同源基因[6-8]。Hepcidin在各物種間具有較高的結(jié)構(gòu)保守性，尤其在成熟肽區(qū)域含有6或8個(gè)半胱氨酸殘基，以致在空間上可形成3或4對(duì)二硫鍵，與其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和生物活性有關(guān)[9]。魚(yú)類hepcidin最早由Shike等[10]從雜交斑紋鱸魚(yú)的鰓中分離到。目前，已在黑鯛、斑點(diǎn)叉尾鮰、尼羅羅非魚(yú)、大黃魚(yú)等多種魚(yú)類中分離克隆到基因[11-14]。雖然已有一些關(guān)于昆蟲(chóng)和兩棲動(dòng)物來(lái)源抗菌肽的原核或真核表達(dá)方面的研究報(bào)道[15-16]，但迄今為止，對(duì)于魚(yú)類抗菌肽的重組DNA表達(dá)研究還鮮有報(bào)道。

在過(guò)去的兩年中，本研究室已分別對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰和尼羅羅非魚(yú)的hepcidin成熟肽實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的成功表達(dá)，且表達(dá)的重組蛋白具有良好的抑制革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌的活性[17-18]，但由于原核表達(dá)系統(tǒng)存在眾所周知的局限性和不足，因而不適合實(shí)際生產(chǎn)中大規(guī)模的制備。據(jù)此，本研究擬通過(guò)建立酵母表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)上述兩種魚(yú)類hepcidin成熟肽的重組DNA表達(dá)。此外，為了擴(kuò)大目的蛋白的抗菌譜和提高表達(dá)量，通過(guò)重疊延伸PCR (Splicing by overlapping extension PCR，SOE- PCR)[19]對(duì)兩種魚(yú)類hepcidin成熟肽的cDNA進(jìn)行了串聯(lián)，并在它們之間添加信號(hào)肽酶切位點(diǎn)，便于分泌表達(dá)時(shí)兩者的分離。本研究為魚(yú)類抗菌肽的基因工程制備奠定了重要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌種

用于質(zhì)粒復(fù)制和cDNA克隆的大腸桿菌DH5α購(gòu)自北京天根生物科技公司；克隆質(zhì)粒pMD19-T simple購(gòu)自日本TaKaRa公司；真核表達(dá)載體pPIC9K及畢赤酵母GS115購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。用于抑菌活性鑒定的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌、大腸桿菌單增李斯特菌、沙門氏菌均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2 試劑

DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、RⅠ和Ⅰ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自日本TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒、DNA分子量marker和蛋白質(zhì)分子量marker購(gòu)自北京天根生物科技有限公司；離子交換層析柱SP-Sepharose購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司；酵母粉 (Yeast extract)、胰蛋白胨 (Tryptone) 購(gòu)自O(shè)XOID公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 基于SOE-PCR的斑點(diǎn)叉尾鮰和尼羅羅非魚(yú)hepcidin成熟肽的cDNA串聯(lián)

編碼斑點(diǎn)叉尾鮰hepcidin成熟肽的cDNA和編碼尼羅羅非魚(yú)hepcidin成熟肽的cDNA分別通過(guò)RT-PCR克隆而來(lái)[17-18]。SOE-PCR的策略如圖1所示，設(shè)計(jì)的各引物序列見(jiàn)表1。以為模板的PCR反應(yīng)體系和條件如下：2.5 μL、各4.0 μL 10 μmol/L的正向引物P1和反向引物P2、50 μL PrimeSTAR?HS (Premix) (TaKaRa，Otsu，Japan)，用無(wú)菌水將反應(yīng)液調(diào)至100 μL；94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；30個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸5 min。以為模板的PCR反應(yīng)體系和條件同上，除了引物為P3和P4、退火溫度改為62 ℃。擴(kuò)增串聯(lián)片段的PCR反應(yīng)體系和條件如下：0.5 μL、0.5 μL、各0.8 μL 10 μmol/L的正向引物P1和反向引物P4、10 μL PrimeSTAR?HS (Premix)，用無(wú)菌水將反應(yīng)液調(diào)至20 μL；94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；10個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸5 min。以該P(yáng)CR產(chǎn)物為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)分別含RⅠ和Ⅰ酶切位點(diǎn)的正向引物Fc和反向引物Rc，用以擴(kuò)增含黏性末端的串聯(lián)片段，PCR反應(yīng)體系如下：2.5 μL、各4.0 μL 10 μmol/L的正向引物Fc和反向引物Rc、1.0 μLplus DNA 聚合酶 (5 U/μL) (TaKaRa，Otsu，Japan)、10 μLplus緩沖液、8.0 μL dNTPs，用無(wú)菌水將反應(yīng)液調(diào)至100 μL；反應(yīng)條件同上述串聯(lián)片段的擴(kuò)增，除了循環(huán)次數(shù)改為30。擴(kuò)增的片段經(jīng)DNA純化試劑盒純化后，與pMD19-T simple載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞.DH5α，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

圖1 SOE-PCR策略圖

1.2.2 pPIC9K-重組表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115

采用限制性核酸內(nèi)切酶RⅠ和Ⅰ對(duì)重組質(zhì)粒“pMD19-T-進(jìn)行酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳割膠回收目的片段后，將其與用同樣酶處理過(guò)的表達(dá)載體pPIC9K按15:1連接 (圖2)，在T4 DNA連接酶作用下，16 ℃保溫20 h，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞.DH5α，通過(guò)菌落PCR、雙酶切和DNA測(cè)序?qū)χ亟M表達(dá)載體pPIC9K進(jìn)行篩選。

pPIC9K經(jīng)Ⅰ酶切線性化后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115，方法如下：將5–10 μL線性重組質(zhì)粒加入80 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞中，一并轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，冰上放置5 min后進(jìn)行電轉(zhuǎn)，條件如下：1.5 kV、25 μF、200 Ω、5 ms；加入600 μL預(yù)冷的1 mol/L山梨醇，30 ℃靜置1–2 h，取適量涂于His–的MD平板上，30 ℃培養(yǎng)至產(chǎn)生單克隆。理論上長(zhǎng)出來(lái)的克隆都是發(fā)生同源重組的His+克隆。

1.2.3 酵母重組轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定

將MD平板上的單菌落依次接種于G418濃度為1.0、2.0、3.0、4.0 g/L的YPD平板上，30 ℃培養(yǎng)2–5 d后篩選高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子；將篩選到的轉(zhuǎn)化子在MD平板上培養(yǎng)以鑒定其Mut+或Mut–表型；提取His+Mut+高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，以此為模板，采用pPIC9K上的通用引物5′和3′，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表1 引物序列

Underlines represent complementary regions, shaded areas represent sequences encoding Kex 2 protease recognition sites.

圖2 重組表達(dá)載體“pPIC9K-mCH-mTH”的構(gòu)建

1.2.4 mCH-mTH在畢赤酵母GS115中的表達(dá)及其純化

挑取篩選到的酵母轉(zhuǎn)化子，接種于BMGY液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250–300 r/min培養(yǎng)至600=2–6，離心后用BMMY液體培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至600約為1.0，進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24 h取上清以備分析，并添加甲醇至終濃度為1%；取誘導(dǎo)表達(dá)72 h的發(fā)酵上清通過(guò)SP-Sepharose陽(yáng)離子交換層析進(jìn)行純化，用20 mmol/L磷酸鈉緩沖液 (pH 6.5) 預(yù)平衡，0.0–1.0 mol/L NaCl進(jìn)行梯度洗脫。純化后的mCH-mTH通過(guò)PBS (140 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4，pH 7.4) 透析后，真空冷凍干燥成粉末，–80 ℃保存?zhèn)溆?。通過(guò)Tricine-SDS-PAGE對(duì)純化的蛋白進(jìn)行鑒定，Tricine濃度為0.1 mol/L，濃縮膠、夾層膠和分離膠的濃度分別為4%、10%和16.5%。

1.2.5 發(fā)酵上清及純化的重組體mCH-mTH的抑菌活性測(cè)定

發(fā)酵液通過(guò)離心后獲得的上清再經(jīng)濃縮10倍后的蛋白質(zhì)濃度約為13.5 mg/mL，將其用于活性測(cè)定。將金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，各取50 μL菌液與20 mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂混合，倒平板；用滅菌打孔器在平板上打6 mm的孔，各孔加入80 μL濃縮上清，空質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的濃縮上清和磷酸鉀緩沖液作為對(duì)照。

另一方面，用預(yù)冷的PBS溶解純化的重組體mCH-mTH粉末，采用Folin酚法測(cè)其濃度為1.4 mg/mL。選擇金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌為待測(cè)菌，分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至600為0.2 (5×107CFU/mL)，1：10稀釋至5×106CFU/mL，分別吸取50 μL至96孔培養(yǎng)板，每孔加入60 μL mCH-mTH，37 ℃培養(yǎng)20 h，陰性對(duì)照組各菌液中加入60 μL PBS；測(cè)定各處理組和對(duì)照組在600的吸光值，計(jì)算存活細(xì)胞率[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 通過(guò)SOE-PCR串聯(lián)的cDNA片段

通過(guò)SOE-PCR，擴(kuò)增到156 bp的含Kex 2蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)編碼序列的“”串聯(lián)片段 (圖3A)；進(jìn)一步以該片段為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)添加RⅠ和Ⅰ限制性酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增到170 bp的目的片段 (圖3B)，經(jīng)DNA測(cè)序確證，該兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)和另兩個(gè)Kex 2蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)“Lys-Arg”的編碼序列均被成功添加 (圖4)。除去所有酶切位點(diǎn)序列，該片段編碼了由25個(gè)氨基酸殘基組成的斑點(diǎn)叉尾鮰hepcidin成熟肽“mCH”和由22個(gè)氨基酸殘基組成的尼羅羅非魚(yú)hepcidin成熟肽“mTH”，兩者均含有8個(gè)保守的半胱氨酸殘基?！癿CH”與“mTH”之間添加的Kex 2蛋白酶酶切位點(diǎn)有利于分泌表達(dá)時(shí)兩者的分離。

2.2 對(duì)于酵母重組表達(dá)系統(tǒng)的鑒定

以重組表達(dá)載體“pPIC9K-”為模板，以5′和Rc為引物，通過(guò)菌落PCR，發(fā)現(xiàn)在約277 bp處有清晰譜帶 (圖5A)，與理論相符；進(jìn)一步采用RⅠ和Ⅰ對(duì)該載體進(jìn)行雙酶切處理，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)存在大、小分子量的兩條譜帶，其中一條約170 bp的小分子量譜帶屬于目的片段 (圖5B)；最終通過(guò)DNA測(cè)序，證明目的片段“”已正確連接至pPIC9K表達(dá)載體，并且核苷酸序列未發(fā)生任何堿基突變。

線性化的“pPIC9K”電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115后，經(jīng)含不同濃度G418的YPD培養(yǎng)基篩選，發(fā)現(xiàn)在含4.0 g/L G418的YPD平板上有13株長(zhǎng)勢(shì)良好的酵母轉(zhuǎn)化子，將這些轉(zhuǎn)化子分別點(diǎn)到MM和MD平板上，進(jìn)一步鑒定其生長(zhǎng)表型，結(jié)果顯示均為正常型Mut+；選擇1個(gè)高拷貝轉(zhuǎn)化子提取其基因組DNA為模板，采用pPIC9K上的通用引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出一條約644 bp的清晰譜帶 (圖6)，與理論值相符，證明目的基因已成功整合進(jìn)酵母染色體中。

圖3 基于SOE-PCR擴(kuò)增的串聯(lián)片段“mCH-mTH”(A) 和對(duì)其添加酶切位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增(B)

2.3 在畢赤酵母GS115中表達(dá)的重組體mCH-mTH及其純化

上述經(jīng)鑒定的高拷貝轉(zhuǎn)化子在BMMY液體培養(yǎng)基中，通過(guò)1%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)120 h。每24 h取樣用于Tricine-SDS-PAGE分析，由圖7可見(jiàn)，誘導(dǎo)表達(dá)24 h時(shí)在理論分子量附近有很淡的譜帶，48 h時(shí)已有明顯的譜帶，至72 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，但因蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)偏高，不能夠顯示確切的分子量。隨后收集表達(dá)72 h的發(fā)酵上清，通過(guò)SP-Sepharose陽(yáng)離子交換層析、采用0.0–1.0 mol/L的NaCl濃度梯度洗脫，對(duì)目的蛋白進(jìn)行分離純化，結(jié)果顯示，經(jīng)1.0 mol/L NaCl洗脫的收集液在1.7–4.6 kDa之間有較寬的單一譜帶 (圖8)，表明被分離的目的蛋白純度較高，經(jīng)Folin-酚法測(cè)定，其濃度為3.2 mg/mL，根據(jù)純化的mCH-mTH的量計(jì)算出表達(dá)量約為77 mg/L。

圖5 重組表達(dá)載體“pPIC9K-mCH-mTH”的菌落PCR (A) 和雙酶切鑒定 (B)

2.4 重組體mCH-mTH的抑菌活性

首先，通過(guò)瓊脂糖彌散法檢測(cè)了濃度為13.5 mg/mL的濃縮上清的抑菌活性，由圖9可見(jiàn)，對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌都顯示了較明顯的抑菌圈。進(jìn)一步通過(guò)微量肉湯稀釋法對(duì)濃度為1.4 mg/mL的純化的重組體mCH-mTH進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，結(jié)果顯示，對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌均有很好的抑制效果，菌株存活率均低于15%，而且對(duì)沙門氏菌的抑菌效果最好，其菌株存活率僅為8.4% (圖10)。

圖6 酵母轉(zhuǎn)化子基因組DNA的PCR鑒定

圖7 誘導(dǎo)表達(dá)不同時(shí)間的目的蛋白的Tricine-SDS- PAGE分析

圖8 純化的重組體mCH-mTH的Tricine-SDS-PAGE分析

圖10 純化的重組體mCH-mTH的抑菌活性測(cè)定

3 討論

抗菌肽在生物體內(nèi)含量甚微，且分子量小，對(duì)其進(jìn)行分離純化困難。迄今為止，已有一些通過(guò)化學(xué)方法合成抗菌肽的研究報(bào)道[21-22]，但費(fèi)用高、活性低。就魚(yú)類hepcidin而言，Huang等報(bào)道了化學(xué)合成的尼羅羅非魚(yú)hepcidin TH2-2無(wú)抑菌活性[13]，究其原因可能與化學(xué)合成的抗菌肽分子難以形成正確的空間構(gòu)象有關(guān)，以致影響了它們的生物學(xué)活性。據(jù)此，本研究通過(guò)SOE-PCR對(duì)編碼兩種魚(yú)類hepcidin成熟肽的cDNA進(jìn)行串聯(lián)，以期提高重組體抗菌肽的表達(dá)量和擴(kuò)大抗菌譜，事實(shí)上，與之前未經(jīng)串聯(lián)、通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得的單個(gè)重組體mCH和mTH的表達(dá)量 (47 mg/L) 和抗菌譜 (抗2個(gè)革蘭氏陽(yáng)性菌和2個(gè)革蘭氏陰性菌) 相比，本研究中獲得的重組體mCH-mTH顯示了更高的表達(dá)量 (77 mg/L) 和更廣的抗菌譜 (抗3個(gè)革蘭氏陽(yáng)性菌和3個(gè)革蘭氏陰性菌)。采用的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)有助于目的蛋白翻譯后的正確折疊，導(dǎo)致其具有良好的生物學(xué)活性[23-24]；此外，分泌到胞外的目的蛋白便于分離純化。在目的蛋白的N端以及在“mCH”與“mTH”之間添加Kex 2蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，以期使目的蛋白在分泌到胞外的過(guò)程中能將信號(hào)肽切除以及將兩者分開(kāi)，確保“mCH”和“mTH”的正確折疊。

發(fā)酵上清經(jīng)陽(yáng)離子交換層析純化后，經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析在1.7–4.6 kDa之間僅顯示一條較深的寬譜帶，但理論上應(yīng)存在3.2 kDa (mCH) 和2.3 kDa (mTH) 的兩個(gè)譜帶，究其原因可能與兩者的等電點(diǎn)很接近有關(guān)，采用SP-Sepharose陽(yáng)離子交換層析無(wú)法將其分開(kāi)，且它們的分子量很接近，Tricine-SDS-PAGE也難以分辨兩個(gè)譜帶。

抑菌實(shí)驗(yàn)顯示純化后的目的蛋白對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌顯示良好的抑菌效果，證明通過(guò)本酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的目的蛋白具有良好的生物學(xué)活性。此外，考慮到生產(chǎn)上大規(guī)模制備時(shí)難以對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化處理，而是直接對(duì)發(fā)酵上清進(jìn)行處理，因此，對(duì)發(fā)酵上清的抑菌活性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均有良好的抑制作用，該結(jié)果為hepcidin抗菌肽的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1] Bulet P, Stocklin R, Menin L. Antimicrobial peptides: from invertebrates to vertebrates. Immunol Rev, 2004, 198: 169–184.

[2] Chanu KV, Kumar A, Kumar S. Structure–activity relationship of buffalo antibacterial hepcidin analogs. Indian J Biochem Biophys, 2011, 48(5): 325–330.

[3] Nicolas G, Viatte L, Bennoun M, et al. Hepcidin, a new iron regulatory peptide. Blood Cell Mol Dis, 2002, 29(3): 327–335.

[4] Krausea A, Neitz S, Magerth J. LEAP-1, a novel highly disulfide-bonded human peptide, exhibits antimicrobial activity. Febs Lett, 2000, 480(2): 147–150.

[5] Park CH, Valore EV, Waring AJ, et al. Hepcidin, a urinary antimicrobial peptide synthesized in the liver. J Biol Chem, 2001, 276(11): 7806–7810.

[6] Tian WJ, Liu JY, Jiang JP. Construction of eukaryotic expression vector of antimicrobial peptide Odorgrin A fromand its transformation into. Chin J Appl Environ Biol, 2010, 16(2): 222–227 (in Chinese).田汶佳, 劉炯宇, 江建平. 無(wú)指盤臭蛙皮膚抗菌肽Odorgrin A真核表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2010, 16(2): 222–227.

[7] Dang XW, Li MY, Chang J, et al. Research progress on hepcidin. J Anhui Agri Sci, 2010, 38(7): 3351–3353(in Chinese).黨曉偉, 李夢(mèng)云, 常娟, 等. Hepcidin的研究進(jìn)展. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(7): 3351–3353.

[8] Douglas SE, Gallant JW, Liebscher RS. Identification and expression analysis of hepcidin-like antimicrobial peptides in bony fish. Dev Comp Immunol, 2003, 27(6/7): 589–601.

[9] Hunter HN, Fulton DB, Ganz T, et a1. The solution structure of human hepcidin, a peptide hormone with antimicrobial activity that is involved in iron uptake and hereditary hemochromatosis. J Biol Chem, 2002, 277(40): 37597–37603.

[10] Shike H, Lauth X, Westerman ME, et al. Bass hepcidin is a novel antimicrobial peptide induced by bacterial challenge. Eur J Biochem, 2002, 269(8): 2232–2237.

[11] Yang M, Wang KJ, Chen JH, et al. Genomic organization and tissue-specific expression analysis of hepcidin-like genes from black porgy (B.). Fish Shellfish Immunol, 2007, 23(5): 1060–1071.

[12] Bao BL, Peatman E, Li P, et al. Catfish hepcidin gene is expressed in a wide range of tissues and exhibits tissue-specific upregulation after bacterial infection. Dev Comp Immunol, 2005, 29(11): 939–950.

[13] Huang PH, Chen JY, Kuo CM. Three different hepcidins from tilapia,: Analysis of their expressions and biological functions. Mol Immunol, 2007, 44(8): 1922–1934.

[14] Wang KJ, Cai JJ, Cai L, et al. Cloning and expression of a hepcidin gene from a marine fish () and the antimicrobial activity of its synthetic peptide. Peptides, 2009, 30(4): 638–646.

[15] Chen YH, Chen QH, Chen K, et al. Optimization of coding sequences and expression of antimicrobial peptide magaininⅡinand. Chin J Biotech, 2014, 30(4): 615–624 (in Chinese).陳玉海, 陳慶煌, 陳科, 等. 抗菌肽magaininⅡ的密碼子優(yōu)化及在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達(dá). 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(4): 615–624.

[16] Ravi C, Jeyashree A, Devi KR. Antimicrobial peptides from insects: an overview. Resin Biotech, 2011, 2(5): 1–7.

[17] Tao Y, Zhao DM, Wen Y. Expression, purification and antibacterial activity of the channel catfish hepcidin mature peptide. Protein Expres Purif, 2014, 94: 73–78.

[18] Wen Y, Tao Y. Hepcidin from Tilapia,: its fusion expression inand antimicrobial activity. J Shanghai Jiaotong Univ: Agri Sci Ed, 2012, 30(4): 68–75 (in Chinese).文雅, 陶妍. 尼羅羅非魚(yú)Hepcidin抗菌肽在大腸桿菌中的融合表達(dá)及其抗菌活性. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào): 農(nóng)業(yè)科學(xué)版, 2012, 30(4): 68–75.

[19] Ho S, Horton R, Hunt H. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene, 1989, 77(1): 51–59.

[20] Cui LW, Yuan QP, Li WJ. Purification and characterization of recombinant human hepcidin expressed in. Biotechnol Bull, 2009, 8: 115–117 (in Chinese).崔力文, 袁其朋, 李文進(jìn). 畢赤酵母工程菌人hepcidin的純化及部分鐵代謝活性研究. 生物技術(shù)通報(bào), 2009, 8: 115–117.

[21] Zanin LM, Alvares DS, Juliano MA, et al. Interaction of a synthetic antimicrobial peptide with model membrane by fluorescence spectroscopy. Eur Biophys J, 2013, 42(11): 819–831.

[22] Sivertsen A, Isaksson J, Leiros HK, et al. Synthetic cationic antimicrobial peptides bind with their hydrophobic parts to drug site II of human serum albumin. Bmc Struct Biol, 2014, 14(1): 1–14.

[23] Cregg JM, Vedvick TS, Raschke WC. Recent advances in the expression of foreign genes in. Biotechnology, 1993, 11(8): 905–910.

[24] Li Z, Moy A, Sohal K, et al. Expression and characterization of recombinant human secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI) protein from. Protein Expres Purif, 2009, 67(2): 175–181.

(本文責(zé)編陳宏宇)

Connection of hepcidin genes from two fish species and their expression in

Wenjing Li1, Yan Tao1, Dongmei Zhao1, and Bingbing Xu2

1 Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China 2 Jiangsu Balu Biotechnology Co., LTD., Nantong 226400, Jiangsu, China

Hepcidin are small cationic peptides with antibacterial activity expressed mainly in the liver of living organisms, and they play important roles in the host’s immune response against microbial invasion and regulation of iron metabolism. Thus, they are considered to be good substitutes for traditional antibiotics. It is a good choice that the antimicrobial peptides are prepared by recombinant DNA expression. In the present study, two hepcidin mature peptide cDNAs from channel catfish () ()and tilapia () () were connected by SOE-PCR in order to obtain more recombinant hepcidin with broad antimicrobial spectrum, andR I andI sites were added to5′- and 3′- ends of the fragment, respectively. The recombinant eukaryotic expression vector “pPIC9K-” was successfully constructed, and transformed intoGS115. The transformants containing multicopy gene insertion were selected by using different concentrations of G418 and other specific mediums, and identified by PCR for yeast genomic DNA. Expression was induced by adding 1% methanol at 30oC for different times. Tricine-SDS-PAGE analysis demonstrated that the most appropriate expression time was 72 h, at which a high expression yield (77 mg/L) for the target protein was exhibited. The highly purified target protein was obtained from the fermentation supernatant by SP-Sepharose cation exchange chromatography. Bacteriostatic activity assay demonstrated that the fermentation supernatant containing the target protein and purified recombinant target protein had bacteriostatic activities against gram-positive and gram-negative bacterium. The present result provides the important initial value for industrial production of hepcidin antimicrobial peptide.

antimicrobial peptide, hepcidin mature peptide,,splicing by overlapping extension PCR

September 10, 2014; Accepted:November 15, 2014

Yan Tao. Tel: +86-21-61900384; E-mail: ytao@shou.edu.cn

Supported by:the Industry-University-Research Cooperation of Shanghai Municipal Education Commission(No. 15CXY30), Foundation of Key Laboratory of Urban Agriculture (South), Ministry of Agriculture, P. R. China (No. UA201307).

上海市教育委員會(huì)產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目(No. 15CXY30)，農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方) 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(No. UA201307) 資助。