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    丙型肝炎病毒NS3蛋白的原核表達及多克隆抗體制備

    2015-07-19 13:05:25孫濤楊光文張金陽夏雪山
    生物工程學報 2015年5期
    關鍵詞:表位丙型肝炎抗原

    孫濤,楊光文,張金陽,2,夏雪山,2

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    丙型肝炎病毒NS3蛋白的原核表達及多克隆抗體制備

    孫濤1,楊光文1,張金陽1,2,夏雪山1,2

    1昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院,云南昆明 650500 2云南省分子醫(yī)學研究中心,云南昆明 650500

    孫濤, 楊光文, 張金陽, 等. 丙型肝炎病毒NS3蛋白的原核表達及多克隆抗體制備. 生物工程學報, 2015, 31(5): 711–721.Sun T, Yang GW, Zhang JY, et al. Prokaryotic expression of Hepatitis C Virus (HCV) NS3 protein and preparation of polyclonal antibody. Chin J Biotech, 2015, 31(5): 711–721.

    提高對丙型肝炎患者實驗室檢測的靈敏度和特異性,對相關人群進行篩查和早期診斷,是控制丙型肝炎病毒(HCV) 流行與傳播的有效措施。為了建立更為可靠的HCV診斷方法,通過采用PCR方法從J6/JFH1 2a型病毒中克隆出HCV基因片段,將其連接到pET-28a載體上,重組載體pET-28a-轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) 后誘導表達,以10% SDS-PAGE進行鑒定,獲得表達的NS3重組蛋白分子量為72 kDa。將純化的NS3蛋白免疫BALB/c小鼠,第4次免疫后采集血液并分離血清進行抗體活性鑒定,小鼠抗體效價為1∶256 000。進一步的Western blotting和間接免疫熒光結(jié)果顯示,以重組NS3蛋白免疫小鼠制備的多克隆抗體可以很好地識別HCV感染Huh7.5.1細胞中的NS3蛋白,為下一步開展單克隆抗體制備和檢測試劑盒研制工作奠定了基礎。

    丙型肝炎病毒,B細胞表位,NS3蛋白,多克隆抗體

    丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV) 是導致丙型肝炎的主要病原體[1]。全球約有2億人感染HCV病毒[2-3],其中70%的感染者會發(fā)展為慢性感染,30%的感染者會通過自身的免疫系統(tǒng)清除體內(nèi)的病毒,其中在慢性感染者中約有5%的病人最終會死于肝硬化和肝細胞癌[4-8]。丙型肝炎病毒是單股正鏈RNA病毒,基因組約長9.5 kb,僅有1個開放閱讀框,編碼約3 000個氨基酸所組成的前體多肽,由宿主蛋白酶和病毒編碼的蛋白酶加工成多個成熟蛋白。目前由于HCV病毒的疫苗類制劑尚未成型,也無特效的治療藥物,臨床治療HCV常采用干擾素α (IFN-α) 聯(lián)合利巴韋林,但應答率較低,盡管目前以依賴RNA的RNA聚合酶 (RNA-dependent RNA polymerase,RdRp) 為靶點的抗病毒藥物索非布韋 (Sofosbuvir) 的使用,較大程度地提高了患者持續(xù)性病毒學應答率 (SVR),但由于病毒在此區(qū)段固然發(fā)生的基因變異,仍可能發(fā)生耐藥性突變,導致該藥物使用仍伴有一定的副作用[9-11]。

    由于HCV主要是通過輸血途徑傳播,提高對丙型肝炎患者檢出的靈敏度和特異性,對相關人群進行篩查和早期診斷,是控制HCV流行與傳播的有效措施。目前HCV病毒的檢測主要有HCV核酸檢測、HCV抗體檢測以及HCV抗原檢測?;颊唧w內(nèi)病毒RNA量直接反應病毒復制的活躍程度,檢測患者體內(nèi)的病毒RNA存在和水平可用于確定感染、評價病程與藥物治療效果。但由于核酸檢測PCR方法的高靈敏性,這種方法對實驗室條件和實驗工作人員要求都很高,容易造成污染,同時還存在病毒變異導致引物不能有效結(jié)合出現(xiàn)假陰性問題。HCV抗體檢測多以HCV核心蛋白、NS3、NS4和NS5非結(jié)構(gòu)蛋白的特異抗體為靶標物,已有金標試紙條和HCV ELISA試劑盒,雖然HCV抗體檢測的第3代ELISA技術(shù)較大提高了檢測靈敏性,但可檢測出抗體的窗口期仍需40多天[12]??贵w檢測靈敏度低,固然存在的“窗口期”,以及免疫缺陷患者不能有效產(chǎn)生抗體,抗體檢測容易漏檢和出現(xiàn)假陰性。抗原檢測靶標直接針對HCV病毒,檢測結(jié)果更為直接可靠。國內(nèi)已有湖南景達生物工程有限公司和山東萊博生物科技有限公司研制的雙抗體夾心法檢測HCV核心抗原診斷試劑,國際雅培ARCHITECT HCV核心抗原檢測試劑也于2012年6月5日獲得SFDA認證注冊。但由于體內(nèi)HCV核心抗原的低水平和相關特異性抗體制備的困難,現(xiàn)有的抗原檢測技術(shù)還存在一些問題。

    HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3分子量為67 kDa,具有絲氨酸蛋白酶和ATP酶及RNA解旋酶活性,是具有重要生物活性的HCV功能蛋白。針對NS3蛋白開發(fā)抗體檢測試劑,其檢測特異性與靈敏性都高于結(jié)構(gòu)蛋白,同時NS3蛋白在HCV感染早期就出現(xiàn),其與特異性抗體親和力和特異性也都很強,且持續(xù)時間較長,這些都決定了NS3蛋白在丙型肝炎的實驗室檢測方面具有較大優(yōu)勢[13]。

    本研究首先使用生物信息學軟件對HCV-NS3蛋白序列的跨膜區(qū)和B細胞抗原表位進行分析和預測,用PCR方法從J6/JFH1 2a型病毒中擴增得到HCV基因片段,成功構(gòu)建了pET-28a-重組載體,在大腸桿菌BL21細胞中成功表達并通過親和層析得到純化的NS3蛋白,免疫小鼠結(jié)果證實其具有很好的抗原性,為以NS3蛋白及相應抗體為檢測靶標的檢測試劑的開發(fā)奠定了基礎。

    1 材料與方法

    1.1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析及抗原表位預測

    采用在線網(wǎng)站服務器ExPASy中ProtScale模塊 (http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl) 預測蛋白質(zhì)疏水性,使用TMHMM server v.2.0在線軟件對HCV-NS3蛋白序列進行跨膜區(qū)預測(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)[14]。使用Swiss-prot蛋白數(shù)據(jù)庫中Swiss-model模塊預測NS3蛋白的三級結(jié)構(gòu),使用DNAstar中Protean模塊對HCV-NS3蛋白的抗原表位進行預測[15]。

    1.2目的基因擴增與純化

    以J6/JFH1 2a型重組病毒 (GenBank Accession No. AY746460.1) 為擴增模板,根據(jù)引物設計原則設計PCR引物 (表1),引物兩端分別加上HⅠ和d Ⅲ酶切位點。培養(yǎng)獲得的J6/JFH1 2a進行病毒核酸提取,作為模板進行全長基因擴增。PCR擴增條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,并回收目的片段進行序列測定確認PCR擴增無誤。

    表1 擴增ns3基因的引物序列

    Notes: the protective bases are marked with bold; the recognition sequences of restriction enzymes are showed in italics;the primers sequences are marked with underline.

    1.3 pET-28a-重組載體構(gòu)建與表達

    將回收的目的基因片段雙酶切后連接到經(jīng)同樣雙酶切的pET-28a載體上,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,PCR鑒定確定陽性克隆,并經(jīng)測序分析進一步驗證。陽性菌的小量培養(yǎng)后,用0.1 mol/L IPTG誘導培養(yǎng)4 h,菌體沉淀用1×SDS上樣緩沖液懸浮并熱處理后,進行10% SDS-PAGE,考馬斯亮藍染色觀察蛋白表達。

    陽性菌擴大培養(yǎng),收集菌體,將菌體懸浮于PBS,冰浴條件下超聲破碎直至菌體清亮。離心棄上清,包涵體沉淀用8 mol/L尿素裂解過夜,取菌體破碎后上清和包涵體裂解液,進行SDS-PAGE。包涵體裂解液以Ni-NTA進行重組NS3蛋白純化,并進行SDS-PAGE驗證。

    1.4 小鼠免疫過程

    取純化后NS3蛋白溶于PBS溶液中,與等量的弗氏完全佐劑充分混勻后,在漩渦振蕩器上振蕩30 min,保證蛋白溶液與弗氏完全佐劑充分混合。第1次免疫小鼠采用小鼠背部和皮下多點注射,隔14 d免疫1次,除第1次使用弗氏完全佐劑外,第2次和第3次均使用弗氏不完全佐劑進行混合,第4次為加強免疫,只注射純蛋白液。

    1.5 小鼠多抗血清的特異性檢測

    用J6/JFH1 2a型病毒感染Huh7.5.1細胞,48 h后棄去培養(yǎng)基,PBS洗3次,以固定液 (甲醇:丙酮=1∶1) 于?20 ℃下固定20 min,風干,同時設未感染病毒的細胞為陰性對照。取第3次免疫的血清 (1∶100) 作為一抗孵育2 h (37 ℃),PBS洗5次后,用FITC標記羊抗鼠 (1∶300) 孵育1 h (37 ℃),PBS避光洗滌5次,熒光顯微鏡下觀察熒光反應。

    將J6/JFH1 2a型病毒感染Huh7.5.1細胞,感染72 h后,棄去培養(yǎng)液,PBS洗3次,用RIPA裂解細胞,1 200 r/min離心5 min,取上清,進行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)膜,取第3次免疫的血清作為一抗 (1∶100) 孵育2 h (37 ℃),HRP標記的羊抗鼠作為二抗孵育1 h (37 ℃),進行Western blotting分析,同時以未感染病毒的細胞作為陰性對照。

    1.6 間接ELISA檢測與進口試劑盒對比實驗

    用美國進口試劑盒 (ORTHO) 按其說明書操作對采自瀘西的692份臨床血清樣本進行ELISA檢測,之后以本實驗室原核表達的NS3蛋白為包被抗原對從中隨機篩出的15份陽性樣品、5份陰性樣品進行檢測,由陰性血清樣品的均值計算出Cutoff值及A/C (Absorbance at 450 nm/Cutoff value) 值,A/C值>1為陽性,反之則為陰性,計算間接ELISA檢測結(jié)果與進口試劑盒檢測結(jié)果的靈敏性及特異性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 蛋白質(zhì)疏水性分析及跨膜結(jié)構(gòu)預測

    通過ExPASy服務器上ProtScale模塊進行在線分析 (圖1),HCV-基因編碼蛋白由632個氨基酸組成,平均疏水性 (Grand average of hydropathicity) 為0.035,結(jié)果顯示其蛋白序列所表達的蛋白整體不存在強的疏水區(qū),只是蛋白N端幾個氨基酸可能存在小的疏水區(qū)。為了降低跨膜區(qū)對蛋白表達的不利影響,使用在線網(wǎng)站預測HCV-NS3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu) (圖2),結(jié)果顯示HCV-NS3蛋白為632個氨基酸,HCV-NS3蛋白沒有典型的跨膜區(qū),HCV-NS3蛋白的1?632個氨基酸都位于細胞膜表面,降低了跨膜區(qū)疏水性氨基酸對蛋白折疊的影響,易于表達和純化。

    圖1 NS3蛋白的疏水性分析

    圖2 NS3蛋白的跨膜區(qū)分析

    2.2 HCV-NS3蛋白三級結(jié)構(gòu)及B細胞抗原表位預測

    通過Swiss-model在線軟件同源建模的方法預測HCV-NS3蛋白三級結(jié)構(gòu) (圖3),HCV NS3蛋白由α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)組成規(guī)則的空間構(gòu)象。該構(gòu)象由α-螺旋位于蛋白內(nèi)部、β-折疊位于蛋白中心,兩者構(gòu)成1個疏水核心區(qū)域;β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲位于蛋白外部,它們結(jié)構(gòu)松散,易變性扭曲。使用DNAstar中Protean模塊中親水方案、表面可及性方案、柔性方案、抗原性方案和抗原指數(shù)方案對HCV-NS3蛋白質(zhì)抗原表位進行綜合分析發(fā)現(xiàn),NS3蛋白全長序列中具有較為豐富且分布均勻的抗原表位 (圖4),主要的抗原氨基酸序列及分布位點 (表2) 所示,有8個優(yōu)勢抗原表位,這些位點的抗原指數(shù)較高,且具有強的表面可及性和親水性位點,因此該蛋白制備抗體具有較強的可行性。

    2.3目的基因擴增及重組質(zhì)粒pET-28a-的構(gòu)建

    以提取、純化的J6/JFH1 2a型病毒核酸為模板,PCR擴增全長基因 (圖5A) 及重組載體pET-28a-雙酶切 (圖5B) 后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,PCR產(chǎn)物長度為1 893 bp,與預期長度一致。該片段經(jīng)回收測序,核酸序列準確無誤。構(gòu)建的載體經(jīng)測序分析,確認插入片段及引物、限制性酶切位點準確無誤。

    2.4 重組蛋白的表達與純化

    陽性菌經(jīng)IPTG誘導表達后,SDS-PAGE分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性菌有約72 kDa的特異性條帶。重組質(zhì)粒在N端和C端共表達分子質(zhì)量約5 kDa 的蛋白,中間的分子質(zhì)量為67 kDa的HCV NS3蛋白,而未加IPTG的重組菌和BL21菌沒有相應的條帶 (圖6),可初步確定HCV基因在重組表達載體中得到正確表達 (圖6)。重組蛋白經(jīng)大量表達后,用Ni Sepharose Fast Flow進行純化,使用梯度洗脫 (圖7),在洗脫緩沖液:結(jié)合緩沖液=6∶4的條件下,純化效果最佳。

    圖3 NS3蛋白三級結(jié)構(gòu)

    圖4 NS3蛋白的特性分析

    表2 DNAstar預測HCV NS3蛋白優(yōu)勢抗原表位的肽段位置

    圖5 PCR及重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果

    2.5 重組蛋白抗體與NS3蛋白的特異性結(jié)合

    采集重組蛋白免疫的小鼠血清,間接免疫熒光法IFA測定血清抗體對J6/JFH1 2a型病毒的結(jié)合情況。結(jié)果表明,J6/JFH1 2a型病毒感染的細胞可以與重組蛋白免疫小鼠抗血清發(fā)生陽性反應,產(chǎn)生特異性的綠色熒光,且可見NS3蛋白主要分布于細胞質(zhì)中 (圖8),而未感染病毒的細胞呈陰性反應,無明顯的熒光出現(xiàn),表明重組蛋白免疫小鼠制備的多抗血清具有很好的特異性。

    圖6 SDS-PAGE檢測重組蛋白在E. coli BL21中的表達

    2.6 Western blotting分析小鼠多抗血清對病毒編碼蛋白的反應性

    Huh7.5.1細胞接種J6/JFH1 2a型病毒,病毒感染72 h收集細胞樣品。用小鼠多抗血清作為一抗進行Western blotting分析,結(jié)果出現(xiàn)與預期分子量大小相符的特異性條帶,而未感染病毒的細胞在此位置無相應條帶出現(xiàn),表明重組蛋白制備的小鼠多抗血清對HCV感染細胞中NS3蛋白的線性抗原表位能夠很好的識別 (圖9)。

    2.7 間接ELISA檢測與進口試劑盒檢測結(jié)果比較

    以純化的大腸桿菌表達的NS3蛋白為抗原包被96孔板對隨機篩出的15份陽性樣品、5份陰性樣品進行ELISA檢測,450處測吸光值并測定A/C值 (表3),經(jīng)測定,陰性對照450均值為0.067,根據(jù)“陰性對照的平均值≤0.05時,Cutoff=2.1×0.05;當陰性對照的平均值>0.05時,Cutoff=2.1×陰性對照均值”的ELISA測定閾值確定原則,所建立方法的Cutoff值為0.141,A/C值>1為陽性,反之則為陰性。利用該方法對20份樣本進行測定,結(jié)果14份為陽性,5份為陰性 (表4),以ORTHO試劑盒結(jié)果作為參照,HCV NS3 ELISA檢測的靈敏性為93.3%,特異性為100%,表明重組蛋白具有很好的靈敏性及特異性。

    圖8 HCV NS3蛋白的IFA分析

    圖9 Western blotting分析小鼠多抗血清的特異性

    表3 ELISA檢測結(jié)果的A/C值

    3 討論

    丙型肝炎病毒 (HCV) 感染是引起慢性肝病的主要病因,病毒一經(jīng)感染,超過70%的感染者最終會發(fā)展為慢性肝炎,嚴重危害人類健康。HCV是一種高度變異的病毒,到目前為止,還沒有有效的疫苗去預防HCV病毒和有效的藥物徹底清除體內(nèi)的病毒顆粒,并且相關的疫苗和藥物研究進展緩慢,及早準確診斷,嚴格控制HCV的感染源頭是控制HCV傳播的有效手段,有研究報道[16]針對HCV核心基因的序列構(gòu)建的M1GS-HCV/C141核酶在體外具有很好的抗HCV活性,也為HCV的后期診斷與治療提供了一條新的研究途徑。

    表4 HCV NS3 ELISA檢測與ORTHO試劑盒檢測結(jié)果比較

    目前用于HCV ELISA檢測所用的抗原主要是多肽合成和基因表達,既有單獨使用,也有混合使用,其主要是核心區(qū)和NS3非結(jié)構(gòu)區(qū)等抗原,但由于我們選擇表達所制備的抗原與天然抗原還存在一些差距,故在檢測中會出現(xiàn)一些漏檢現(xiàn)象,進而影響檢測的特異性和靈敏性。在HCV感染者血清中絕大多數(shù)都有NS3非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的出現(xiàn)且持續(xù)存在。NS3蛋白抗原免疫性強,存在多個抗原表位,容易檢測患者體內(nèi)感染的HCV病毒。Murphy等[17]研究發(fā)現(xiàn),基因表達的蛋白分子量很大,具有很強的免疫原性,可以引起機體特異性細胞免疫反應,誘導機體產(chǎn)生大量的干擾素,幫助機體清除病毒和抑制病毒的大量復制。我們研究發(fā)現(xiàn),全長基因很保守,沒有較強的疏水區(qū),蛋白存在多個優(yōu)勢抗原表位,且還攜帶多個目標抗原以及輔助性表位,能夠有效地應對病毒的變異和免疫反應中HLA的限制性[18]。再者,其多個優(yōu)勢抗原表位主要存在于N端且又包括了C端除疏水區(qū)外的大部分蛋白,故既有利于蛋白的表達與純化又有利于C端抗原決定簇的存在。抗原表位的覆蓋面大,能覆蓋更多的基因型和亞型,所設計的藥物對絕大部分人群都有用,對誘導細胞免疫反應的強度和廣度以及在病毒清除中起著重要作用。由于HCV NS3蛋白還具有NS3絲氨酸蛋白酶、三磷酸核苷酶 (NTPpase) 和螺旋酶 (Helicase) 活性[19-22]。也有研究表明[23],HCV NS3蛋白的NTP酶和解旋酶功能區(qū)同樣可以誘導產(chǎn)生體液免疫,而且NTPase及Helicase酶能使NS3蛋白結(jié)合到HCV基因組的3'末端上,在病毒RNA復制中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[24-26]。所以在HCV感染者篩查方面使用NS3蛋白作為抗原,NS3蛋白的多個優(yōu)勢抗原表位能夠充分暴露其抗原決定簇和伸展氨基酸的活性組分,更好地提高檢測靈敏度和免疫原性,有效避免HCV感染者的漏檢,這也是目前HCV在血清學檢測上多選擇NS3蛋白作為抗原的原因。

    綜上所述,本研究成功地將HCV全長基因連接到pET-28a表達載體中,誘導表達出分子質(zhì)量約為72 kDa的重組蛋白并且通過His標簽純化出蛋白,免疫小鼠后制備出高效價的多克隆抗體。目前關于HCV NS3蛋白的多克隆抗體制備的條件已經(jīng)很成熟,相關檢測試劑盒都已經(jīng)成熟化,而且單抗試劑盒也已經(jīng)進入市場,但其都存在一定的缺陷。首先,目前關于NS3多克隆抗體制備的文獻報道中,大多是通過ELISA法對其進行特異性及靈敏性驗證,由于我們對抗原的選擇區(qū)域相比于天然抗原還存在一定的差距,故對其靈敏性及特異性的要求就會很高,而本實驗主要通過IFA對其進行驗證,相比于ELISA法,IFA更能擴大抗體應用范圍,而且血清可以通過Huh7.5.1細胞傳代進行吸收,大大提高了所制備抗體的特異性;而目前國外單抗檢測試劑盒主要以Anti-HCV-NS3單抗檢測試劑盒 (Abcam公司) 為主,其特異性及靈敏性都很好,但其反應強度不如多抗,價格昂貴且抗體只針對1種抗原決定簇,比較單一。故本研究通過對HCV NS3蛋白進行生物信息學分析,挖出其優(yōu)勢抗原表位進行表達,并通過IFA方法對所制備的多抗進行驗證,更加肯定了其特異性,并準備以該抗體為基礎建立競爭性ELISA,進一步提高HCV抗體檢測的靈敏性以及為第3代HCV抗體檢測試劑的改進和完善提供有力的工具。

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    (本文責編陳宏宇)

    Prokaryotic expression of Hepatitis C Virus (HCV) NS3 protein and preparation of polyclonal antibody

    Tao Sun1, Guangwen Yang1, Jinyang Zhang1,2, and Xueshan Xia1,2

    1 Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, Yunnan, China 2 Research Center of Molecular Medicine of Yunnan Province, Kunming 650500, Yunnan, China

    ToincreasedetectionsensitivityandspecificityonhepatitisC virus(HCV)isvitalforpreventionand controllingofthedisease.Toestablishamorereliable detection method for HCV diagnosis, the full gene fragment of(non-structural protein of HCV) fromrecombinantplasmid of J6/JFH1 2awasamplifiedandthenconnectedintothepET-28a prokaryoticexpressionvector,andthelatterwassubsequentlytransformedintoBL21 (DE3) to havethetargetproteinexpression. Asaresult,aproteinwith amolecularweightof72kDawasobtainedandvisualized in 10%SDS-PAGE.The purifiedNS3 proteinwasusedasimmunogentoinoculateBALB/c miceandthe serawascollected afterthefourthimmunization.Theantibodytiterofserumisdeterminedtobe about1:256 000withELISA. Western blotting and indirectimmunofluorescenceanalysisshowedthatthe mousepolyclonal antibodycouldreactspecificallywiththenativeNS3protein in Huh 7.5.1 cellsinfectedwithHCV.Thesefindingsmayprovide basisfor further preparation of monoclonal antibodies against NS3 and the development of related detection kit.

    Hepatitis C virus (HCV), B cell epitopes, NS3 protein, polyclonal antibodies

    September 13, 2014; Accepted:December 10, 2014

    Xueshan Xia. Tel: +86-871-65939528; E-mail: oliverxia2000@aliyun.com Jinyang Zhang. Tel: +86-871-65939528; E-mail:zhangjinyangzjy@163.com

    Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 81260248), National Science and Technology Surport Program of China (No. 2014BAI01B01), Applied Basic Research Projects of Yunnan Province (No. KKS0201326002), Found for Fostering Talents of Kunming University of Science and Technology (No. KKSY201326085), Construction of Science and Technology Innovation Platform of Yunnan Province (No. 2012DA002).

    國家自然科學基金 (No. 81260248),國家科技支撐計劃項目 (No. 2014BAI01B01),云南省應用基礎研究計劃 (No. KKS0201326002),昆明理工大學人才培養(yǎng)基金 (No. KKSY201326085),云南省科技創(chuàng)新平臺建設計劃 (No. 2012DA002) 資助。

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