不同產(chǎn)地金銀花中綠原酸及木犀草苷的快速檢測

趙君峰　張彬　張紅梅

摘要 [目的]利用HPLC法同時檢測不同產(chǎn)地金銀花中綠原酸和木犀草苷。[方法]采用迪馬公司Kromasil-C18色譜柱（250×4.6 mm，5 μm ），以甲醇-1%磷酸為流動相進行梯度洗脫，檢測波長為350 nm，柱溫為室溫，流速1 ml/ min，進樣量5 μl。[結(jié)果]綠原酸濃度在0～1 mg/ml內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系（r=0.999 1），回收率為98.79%～101.67%，相對標準偏差為1.05%；木犀草苷濃度在0～0.1 mg/ml內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系（r=0.998 7），回收率為98.06%～101.17%，相對標準偏差為1.17%。[結(jié)論]該方法可同時測定金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量，結(jié)果準確度高、精密度好，可為金銀花藥材的質(zhì)量控制研究提供一種可靠的參考方法。

關(guān)鍵詞 金銀花；綠原酸；木犀草苷；高效液相色譜法

中圖分類號 S567.7+9 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2015）15-061-02

Rapid Detection of Chlorogeic Acid and Galuteolin in Honeysuckle from Different Places

ZHAO Junfeng， ZHANG Bin， ZHANG Hongmei （School of Food and Bioengineering， Henan University of Science and Technology， Luoyang， Henan 471023）

Abstract [Objective] The high performance liquid chromatographic method was developed for determination of chlorogenic acid and galuteolin simultaneously in different honeysuckle.[Method] Kromasil-C18 Column（250×4.6 mm， 5 μm）was used for gradient elution with a mobile phase of mixture of methanol-1% phosphoric acid solution at a flow rate of 1.0 ml/min with the detection wavelength of 350 nm at room temperature.[Result] The calibration curve was linear in the range of 0-1 mg/ml for chlorogenic acid （r=0.999 1）， and the recovery of chlorogenic acid was 98.79%-101.67% with relative standard deviation （RSD） of 1.05%.The calibration curve was linear in the range of 0-0.1 mg/mL for galuteolin （r=0.998 7）， and the recovery of galuteolin was 98.06%-101.17% with relative standard deviation （RSD） of 1.17%.[Conclusion] This method is sensitive， reliable and can be applied to determine chlorogenic acid and galuteolin in the material of honeysuckle.

Key words Honeysuckle； Chlorogenic acid； Galuteolin； HPLC

金銀花（Flos Lonicerae）為忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬屬（Lonicera）植物忍冬（Lonicerajaponica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒、涼散風熱的功能，用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發(fā)熱諸病[1]。有機酸類和黃酮類化合物為金銀花藥材的主要有效成分[2]，綠原酸和木犀草苷已作為金銀花藥材含量測定的指標性成分收入2010年版《中國藥典》[1]。以前對綠原酸和木犀草苷的測定均是分別進行的[3-4]，近年來有學(xué)者利用轉(zhuǎn)換波長法實現(xiàn)了對綠原酸及木犀草苷的同時檢測[5]。筆者以綠原酸和木犀草苷作為指標性成分，采用高效液相法在同一波長下同時測定綠原酸和木犀草苷含量，為金銀花藥材提供了更為簡單合理的質(zhì)控方法。

1 材料與方法

1.1 試藥 金銀花，收集自金銀花主產(chǎn)區(qū)河南、山東、四川、重慶等地（表1），經(jīng)西南大學(xué)園藝園林學(xué)院植物學(xué)教研室白志川教授鑒定為忍冬科忍冬屬植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾；綠原酸標準品，中國藥品生物制品檢定所，批號110753-200413；木犀草苷標準品，中國藥品生物制品檢定所，批號11753-200413；甲醇，色譜純，美國Fisher試劑公司；水，雙蒸水；其他試劑，均為分析純。

1.2 儀器 LC-2010A高效液相色譜儀，包括PDA二極管陣列檢測器、LCMS SOLUTION Version 3.0色譜工作站、C 670-12098-11型手動注射器，日本島津；KQ5200超聲清洗儀， 江蘇昆山超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件。色譜柱為Diamonsil（鉆石）HPLC色譜柱（美國迪馬公司） Kromasil C18 5 μm，250×4.6 mm；柱溫為室溫，流速1 ml/ min，進樣量5 μl； 流動相為甲醇-1%磷酸；檢測波長為350 nm。

1.3.2 對照品溶液制備。

精密稱取五氧化二磷真空干燥24 h的木犀草苷標準品1 mg，置10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成0.1 mg/ml的母液；精密稱取干燥24 h的綠原酸標準品10 mg，置10 ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成1 mg/ml的母液。

1.3.3 供試品溶液制備。

取金銀花樣品，干燥，粉碎，過40目篩，準確稱量約0.5 g，置200 ml帶塞三角瓶，加入甲醇50 ml，超聲30 min，冷卻至室溫，濾紙過濾，用甲醇洗滌殘渣2次，定容至50 ml，再用0.22 μm有機濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.3.4 方法學(xué)考察。

1.3.4.1 標準曲線的繪制。將綠原酸標準品母液稀釋分別配成0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mg/ml不同濃度的綠原酸標準溶液，將木犀草苷標準品母液稀釋分別配成0.01、0.03、0.05、0.07、0.10 mg/ml不同濃度的木犀草苷標準溶液，分別進樣5 μl，在350 nm波長條件下進行測定，以標準品濃度（mg/ml）為縱坐標（Y）、成分峰峰面積積分值為橫坐標（X）繪制標準曲線。

1.3.4.2 精密度試驗。

取金豐一號金銀花樣品，按“1.3.3”制備供試品，連續(xù)進樣6次，按“1.3.1”色譜條件檢測綠原酸及木犀草苷峰面積，并計算RSD，要求該值小于3%。

1.3.4.3 重復(fù)性試驗。

取金豐一號金銀花樣品6份，按“1.3.3”制備供試品，按“1.3.1”色譜條件檢測綠原酸及木犀草苷峰面積，并計算RSD，要求該值小于3%。

1.3.4.4 穩(wěn)定性試驗。取金豐一號金銀花樣品，按“1.3.3”制備供試品，分別在0、2、4、8、16、24 h，按“1.3.1”色譜條件檢測綠原酸及木犀草苷峰面積，并計算RSD，要求該值小于3%。

1.3.4.5 加樣回收率試驗。

取已知含量金銀花金豐一號樣品粉末，精密稱取樣品約0.5 g，共取6份，分別加入綠原酸（木犀草苷）對照品適量，按照“1.3.2”樣品供試液制備方法進行操作，制得供試品溶液。分別計算綠原酸及木犀草苷樣品的加樣回收率。

1.3.5 樣品的含量測定。將不同產(chǎn)地的金銀花樣品供試液用高效液相色譜儀測定峰面積，再分別按照標準曲線回歸方程求得各樣品中綠原酸及木犀草苷含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 標準曲線的繪制。以綠原酸和木犀草苷標準品濃度（mg/ml）為縱坐標（Y）、成分峰峰面積積分值為橫坐標（X）繪制標準曲線，得出綠原酸與木犀草苷回歸方程分別為Y=1.524 4×10-7X -0.019 1（r= 0.999 1）、Y=4×107X-103 461（r=0.998 7），表明綠原酸在0～1 mg/ml、木犀草苷在0～0.1 mg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.2 精密度試驗。按“1.3.4.2”方法操作，計算得出綠原酸和木犀草苷峰面積的RSD分別為1.6%、1.7%（n=6），表明在此試驗條件下精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性試驗。按“1.3.4.3”方法操作，計算得出綠原酸和木犀草苷峰面積的RSD分別為2.0%、2.1%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗。按“1.3.4.4”方法操作，計算得出綠原酸和木犀草苷峰面積的RSD分別為1.8%、2.1%（n=6），表明該溶液在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.1.5 加樣回收率試驗。由表2可見，綠原酸和木犀草苷的平均回收率分別為98.79%、99.61%，RSD分別為1.05%、1.17%，表明該方法準確、可靠，可用于金銀花中綠原酸和木犀草苷的含量測定。

2.2 綠原酸和木犀草苷含量測定 由表3可見，HPLC測定所得20批不同產(chǎn)地金銀花中綠原酸含量為1.43%～5.34%，木犀草苷含量為0.01%～0.46%，與藥典要求相一致；其中四川、河南地區(qū)金銀花中綠原酸及木犀草苷含量較高。

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

取金銀花粉末（13號金豐一號）0.5 g，分別精密加入甲醇、氯仿、石油醚、丙酮50 ml，超聲提取30 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇作溶劑提取出的綠原酸和木犀草苷含量高，所以選擇甲醇作為提取溶劑。

3.2 提取方法的選擇

取金銀花粉末（13號金豐一號）0.5 g，精密加入甲醇50 ml，采用超聲法、浸提法、微波法、回流法、浸提后超聲5種方法進行對比試驗，結(jié)果表明，浸提法、微波法提取方法簡單，但提取效果較差；浸提后超聲法和超聲法提取效果差別不大；回流法提取效果比較好，但操作過于復(fù)雜。由于超聲法操作簡單、提取效果較好，故選取超聲法作為金銀花供試液的提取方法。

3.3 提取時間的選擇

取金銀花粉末（13號金豐一號）0.5 g，精密加入甲醇50 ml，分別超聲處理15、30、45、60 min。結(jié)果表明，30 min即可將0.5 g金銀花中的綠原酸和木犀草苷提取完全，故選取30 min作為超聲提取的最佳時間。

3.4 波長的選擇

目前，綠原酸和木犀草苷已作為金銀花藥材含量測定的指標性成分收入2010年版《中國藥典》，《中國藥典》2005年版第一部中金銀花和木犀草苷含量的測定需分別進行，費時費力，為了節(jié)省時間、提高效率，該研究利用梯度洗脫將2種成分同時測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)色譜圖中2個目標峰峰形較好，與雜質(zhì)峰均能達到基線分離。綠原酸最佳吸收波長為327 nm、木犀草苷最佳吸收波長為350 nm。該研究建立了350 nm下金銀花藥材中綠原酸和木犀草苷的HPLC同時測定方法。利用該法對20組金銀花樣品進行檢測，測得金銀花中綠原酸、木犀草苷的含量分別為1.43%～5.34%、0.01%～0.46%，與《中國藥典》2005年版一部中規(guī)定的金銀花中綠原酸量不得少于1%、木犀草苷不得少于0.1%[6]相一致，表明采用同一波長完全可以實現(xiàn)綠原酸及木犀草苷的同時檢測。通過該試驗，表明了以綠原酸為指標計算，四川宜賓（4號）產(chǎn)的金銀花含量最高，其次是河南封丘（13號）和重慶秀山（8號）產(chǎn)的金銀花；而以木犀草苷為指標計算，河南封丘（13號）產(chǎn)的金銀花含量最高，其次是山東（7號）產(chǎn)的金銀花。

參考文獻

[1]

國家藥典委員會.中國藥典·一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：205.

[2] 武曉紅，田智勇，王煥.金銀花的研究新進展[J].時珍國醫(yī)國藥， 2005， 16（12）： 1303-1304.

[3] 時軍波，徐娜，劉長安，等.金銀花不同部位中綠原酸和木犀草苷含量的測定[J].化學(xué)分析計量， 2010（6）：45-47.

[4] 宋平順， 衛(wèi)玉玲，陶耀武， 等.不同產(chǎn)地金銀花中綠原酸和木犀草苷含量的HPLC法測定[J].甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 2008， 25（5）： 31.

[5] 辛華，豐杰，程若敏，等.HPLC 測定不同產(chǎn)地金銀花中綠原酸和木犀草苷[J].中國實驗方劑學(xué)雜志， 2011，17（2）：60-63.

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