抗錳細(xì)菌的分離鑒定及其對生豬養(yǎng)殖糞水中錳的去除效果

許愛清，向言詞，楊光璽，郭盈希，宋早文

(1.湖南科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南 湘潭 411201；2.江門出入境檢驗檢疫局，廣東 江門 529000)

錳(Mn)是生物體必需的礦質(zhì)元素。人體缺錳會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，但過量的錳對人體健康和人們的生活質(zhì)量都有很大的危害[1–2]。錳礦廢棄地、錳礦尾渣和電解金屬錳、二氧化錳、鋼鐵冶煉等產(chǎn)生的含錳廢物及高錳含量的地下水、地表水等是錳污染的主要來源[3]。中國湖南、重慶和貴州3 地交界處的錳礦產(chǎn)業(yè)十分發(fā)達(dá)，是當(dāng)今世界名列前茅的電解錳和錳礦石生產(chǎn)基地，當(dāng)?shù)丨h(huán)境錳污染嚴(yán)重。湖南湘潭錳礦經(jīng)歷了近1個世紀(jì)的開采，錳污染已經(jīng)對當(dāng)?shù)貎和纳L發(fā)育造成了一定程度的不利影響[4]。對錳污染地區(qū)進(jìn)行治理已顯得極為迫切。

在生豬規(guī)?；B(yǎng)殖過程中有大量糞污廢水產(chǎn)生。這些廢水含有豐富的有機(jī)質(zhì)、氮磷以及銅、鋅、砷等重金屬元素，易對環(huán)境造成污染和破壞[5]。在畜牧業(yè)和飼料工業(yè)中，錳元素通常以硫酸錳、蛋氨酸錳、葉綠素鐵錳鹽等形式添加到動物飼料中，以促進(jìn)畜禽的良好發(fā)育，取得催肥效果。豬飼料中過量的錳元素大部分隨糞便或尿液排出體外。目前，關(guān)于生豬規(guī)模化養(yǎng)殖過程導(dǎo)致的錳污染防治鮮見報道。

1913年，Beijerinck 首次報道細(xì)菌對錳(II)的氧化作用，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在水體、土壤和沉積物中均含有豐富的錳氧化菌[6]。錳氧化菌能使可溶性低價態(tài)錳(Mn2+)氧化生成不溶氧化態(tài)錳，如MnO2。這一自然現(xiàn)象能為錳污染的微生物修復(fù)提供指引。筆者研究抗錳細(xì)菌的分離鑒定與生豬養(yǎng)殖糞污廢水的除錳方法，旨在為生豬養(yǎng)殖糞污廢水的沉降除錳處理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從湘潭錳礦的礦石和錳尾礦壩的雜草根際采集土壤樣本，保存于密封塑料袋中，用于抗錳菌種的篩選、分離。生豬養(yǎng)殖糞污廢水采集于湘潭市某生豬養(yǎng)殖場。

牛肉膏蛋白胨固體平板培養(yǎng)基用牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂20g、去離子水1 000mL 配制?？瑰i菌選擇性固體平板培養(yǎng)基以0.1%(或0.5%) MnSO4·H2O 替代牛肉膏蛋白胨平板中的氯化鈉(下文分別稱其為抗錳菌(0.1%)選擇性固體平板和抗錳菌(0.5%)選擇性固體平板)。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器有MycyclerTMThermal Cycler PCR 儀(美國伯樂公司，Bio–Rad)、PowerPacTMBasic 電泳儀(美國伯樂公司，Bio–Rad)、Kodak Gel Logic 212凝膠成像系統(tǒng)(Carestream Health INC.,USA)、尼康E100 生物顯微鏡系統(tǒng)(NIKON)和AA–7000 原子吸收分光光度計(日本島津)。

含錳培養(yǎng)液用牛肉膏5g、蛋白胨10g、MnSO4·H2O 1～50g、去離子水1 000mL 配制而成。TaKaRa TaqTMDNA 多聚酶試劑盒(含TaKaRa Taq和10× PCR 緩沖液購于寶生物(大連)工程有限公司。16S rDNA PCR 通用引物對27F(5’–AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG–3’)和1492R(5’–GGY TAC CTT GTT ACG ACT T–3’)由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。dNTPs (各2.5 mmol/L)購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。亮柏藍(lán)I(Leucoberbelin blue I，LBB)試劑為安耐吉化學(xué)產(chǎn)品。Mn2+標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000μg/mL)為國家有色金屬及電子材料分析測試中心產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 抗錳菌株的分離與純化

取土壤樣品1g 加入到99mL 滅菌生理鹽水中，配成稀釋度 1∶100 的土壤懸液，輕微振蕩，靜置10min 后，用滅菌移液管移取其上層液體進(jìn)行10 倍系列梯度稀釋，得到稀釋度1∶100、1∶1 000、1∶10 000 的懸液。分別移取0.2mL 稀釋菌液涂布于牛肉膏蛋白胨固體平板和抗錳菌(0.1%)、抗錳菌(0.5%)選擇性固體平板，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。每組重復(fù)3次。采用菌落計數(shù)法計數(shù)土壤中細(xì)菌總數(shù)和抗錳細(xì)菌的數(shù)量。從抗錳菌(0.5%)選擇性固體平板上挑取單菌落數(shù)個，分別轉(zhuǎn)接到空白的抗錳菌(0.5%)選擇性固體平板上，用劃線分離單菌落，28℃培養(yǎng)2～3 d，得到抗錳細(xì)菌純菌種，轉(zhuǎn)接于試管斜面，28℃培養(yǎng)，待長滿斜面后4℃保存?zhèn)溆谩＿x取1 株在抗錳菌(0.5%)選擇性固體平板表面產(chǎn)生黃紅色色素的抗錳菌，用于后續(xù)研究。

1.3.2 所選取菌株的形態(tài)學(xué)特征觀察

用肉眼直接觀察所選取菌株在固體平板生長的菌落形態(tài)和在液體培養(yǎng)基中的生長特性。挑取試管斜面上的菌苔制成涂片，經(jīng)結(jié)晶紫簡單染色后，在普通光學(xué)顯微鏡油鏡下觀察菌體細(xì)胞的形態(tài)。

1.3.3 所選取菌株的16S rRNA 基因序列分析

28℃下，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中接種所選取菌株，振蕩培養(yǎng)36～48 h 后，將培養(yǎng)液10 000 r/min離心10min，收集菌體細(xì)胞。采用SDS 堿裂解法抽提細(xì)菌基因組DNA，以1.0%瓊脂糖電泳檢測DNA質(zhì)量，－20℃保存，備用。用細(xì)菌16 S rDNA 特異性通用引物27F/1492R 擴(kuò)增菌株的16S rRNA 基因片段。PCR 反應(yīng)體系：10×Buffer(Mg2+plus)5.0 μL、dNTPs (各2.5 mmol/L) 1.0 μL、引物27F (20 μmol/L)和1492R(20 μmol/L)各1.0 μL、TaKaRa Taq (5 U/μL) 0.25 μL、DNA 模板1.0 μL，向體系中加入PCR 水至50 μL。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，然后委托生工生物工程(上海)股份有限公司測序，得到該菌株的16S rDNA 大部分序列。在GenBank 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) 中， 通 過BlastN 程序進(jìn)行相似序列的搜索對比，以E 值 (expectation values)<1.0e–05 為標(biāo)準(zhǔn)判別同源比對的顯著性意義。通過 BankIt 軟件提交序列到GenBank 中。參照LPSN 數(shù)據(jù)庫(http://www.bacterio. net/)中沙雷氏菌屬的菌種名和模式菌株的16 S rDNA 序列登錄號，從GenBank 的nucleotide 數(shù)據(jù)庫中搜索，并選擇適當(dāng)?shù)哪Ｊ骄甑?6S rDNA 序列。將所選取菌株和模式菌株的16S rDNA 序列在ClustalW1.83 程序中進(jìn)行多序列比對，然后再利用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA5.10 構(gòu)建N–J 系統(tǒng)發(fā)育樹(Neighbor–Joining tree)。系統(tǒng)發(fā)育樹可靠性檢測的自舉值設(shè)定為1 000次。以大腸桿菌的模式菌株為外群[7]確定所選取菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.3.4 所選取菌株對MnSO4耐受能力的測定

配制含Mn2+培養(yǎng)液各20mL，分別以0、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%、0.60%、0.70%、0.80%、0.90%、1.00%、2.00%、3.00%、4.00%和10.00% MnSO4·H2O 替代牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中0.5%的NaCl。將接種量為1%且培養(yǎng)18 h 后的液體菌種接種到不同MnSO4含量的培養(yǎng)液中，28℃培養(yǎng)箱中150 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌體的生長濁度和產(chǎn)生色素的情況來評價所選取菌株對錳的耐受能力。

1.3.5 所選取菌株對Mn2+吸附沉降作用的測定

分別配制MnSO4濃度0.005、0.010、0.015、0.020 mol/L 的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液，分別取20mL 盛裝于100mL 三角瓶中，2個重復(fù)。接種培養(yǎng)18 h 的菌種到各培養(yǎng)液中，分別置于28、37℃振蕩培養(yǎng)，48 h 后，以10 000 r/min 離心15min，收集上清液，用去離子水適當(dāng)稀釋上清，使其中Mn2+的質(zhì)量濃度在火焰原子吸收光譜法測定的線性范圍內(nèi)(0～5mg/L 或0～0.09 mmol/L)，采用火焰原子吸收光譜法測定上清液中Mn元素的質(zhì)量濃度(M1)。根據(jù)M1與稀釋倍數(shù)(N)之積計算出培養(yǎng)液中的錳殘留量(M2)。M2與最初培養(yǎng)液中添加的Mn2+質(zhì)量(M0)之差(ΔM)為錳去除量，ΔM 與M0之比為錳去除率。根據(jù)錳去除率的大小評價菌體對錳的吸附沉降能力。

1.3.6 所選取菌株對Mn2+氧化作用的測定

采用LBB 指示劑法[8]檢測氧化錳是否生成及其生成的量，測定原理為：環(huán)境中的錳離子被錳氧化細(xì)菌氧化，生成氧化錳，將培養(yǎng)液離心后，生成的氧化錳與菌體一起沉淀下來。當(dāng)存在高價錳(III～VII)時，LBB 的顯色基團(tuán)被氧化，生成藍(lán)色物質(zhì)，而且LBB 的顯色反應(yīng)不受Mn2+或Fe2+等其他離子的干擾。分別配制含0.01 mol/L MnSO4和0.01 mol/L MnCl2的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液，接種所選取菌株，在28℃振蕩培養(yǎng)后，10 000 r/min 離心，收集菌體和黑褐色沉淀物。用0.045 mol/L 的醋酸配制0.04%的LBB 溶液25mL。取沉淀物，用40mL超純水懸浮后各取1.0mL，將其與5mL 的 0.04% LBB 混合，并輕微振蕩，混勻，置于黑暗處過夜，觀察溶液顏色的變化。

1.3.7 所選取菌株對生豬養(yǎng)殖糞污廢水錳去除作用的測定

將溫度、pH、接種量3個因素進(jìn)行L9(34) 正交試驗。取生豬養(yǎng)殖糞污廢水50mL 分裝于三角瓶，直接接種所選取菌株的液體菌種，150 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h 后，以10 000 r/min 離心15min，收集上清液，用原子分光光度計檢測上清液中Mn2+的含量。以錳去除率為響應(yīng)指標(biāo)對正交試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 所篩選菌株的形態(tài)特征

稀釋涂布平板法計數(shù)結(jié)果表明，土壤樣品中細(xì)菌總數(shù)、抗0.1% MnSO4的細(xì)菌數(shù)以及抗0.5% MnSO4的細(xì)菌數(shù)都約為3×105CFU/g。平板上生長的菌落形態(tài)有多種，挑取含 0.5% MnSO4平板上的1個略顯紅色的菌落，經(jīng)劃線分離純化后，得到1 株抗錳菌細(xì)菌，將其定名為KM01。28℃下培養(yǎng)48 h，該菌株在牛肉膏蛋白胨斜面上產(chǎn)生鮮紅的紅色素(圖1)。將KM01 在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，在28℃下菌液呈鮮紅色，在37℃下不產(chǎn)生紅色素(圖2)。在油鏡下染色觀察，KM01 為桿菌。據(jù)此生長形態(tài)特性，初步判斷KM01 為粘質(zhì)沙雷氏菌。

圖1 抗錳菌KM01 的斜面狀態(tài) Fig.1 Slant of Mn-resistant strain KM01

圖2 在溫度28℃(左)和37℃(右)下抗錳菌KM01培養(yǎng)液的顏色 Fig.2 Broth color of the Mn-resistant strain KM01 under 28 ℃ and 37℃

2.2 KM01 的16S rRNA 基因序列分析

提取KM01 的基因組DNA，采用細(xì)菌16S rDNA特異性通用引物27F/1492R 對其16S rDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)測序，得到1 462 nt 核苷酸序列，提交到GenBank 數(shù)據(jù)庫中的登錄號為KF206118。將該序列在GenBank 中用BLAST 程序進(jìn)行搜索對比，結(jié)果表明，它與沙雷氏菌屬(Serratia)中一些菌株的16S rDNA 序列的一致性高達(dá)99%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，KM01 與粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)聚類在一個分支(圖3)，二者之間的親緣關(guān)系最近，因此，可以確定KM01 是一種沙雷氏菌，定名為Serratia sp. KM01。

圖3 基于16 S rRNA基因構(gòu)建的N–J系統(tǒng)發(fā)育樹指示菌株KM01與沙雷氏菌屬的親緣關(guān)系 Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic consensus tree based on the 16S rRNAgene sequences showing the relationships between strain KM01 and type strains of thegenus Serratia

2.3 KM01 對MnSO4的耐受能力

以 1%接種量接種液體菌種于含 0 ～10% MnSO4的培養(yǎng)液中，在28℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h 后，在含0～4% MnSO4的培養(yǎng)液中，菌體細(xì)胞懸液濃密渾濁，而且隨Mn2+含量的增大，菌液顏色由紅色變成黃色，表明菌株KM01 能耐受4%的MnSO4。

2.4 KM01 對Mn2+的吸附沉降作用

依據(jù)錳元素的火焰原子吸收光譜法測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)，計算出培養(yǎng)液上清中錳的殘留量和去除率(表1)，結(jié)果表明，在培養(yǎng)液中Mn2+質(zhì)量濃度低于825mg/L(亦即0.015 mol/L)、28℃下培養(yǎng)時，菌株KM01 對錳的去除率在89%以上。各組在28℃培養(yǎng)時的沉降除錳能力比在37℃時的強(qiáng)，表明28℃更適宜菌體生長與除錳能力的發(fā)揮。

圖4 火焰原子吸收光譜法測定Mn2+含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig.4 Standard curve for Mn2+ concentration detected by flame atomic absorption spectroscopy

表1 火焰原子吸收光譜法測定的上清液中錳的殘留量 Table 1 Mn residue in the supernatant detected by flame atomic absorption spectroscopy

2.5 KM01 對Mn2+的氧化作用

抗錳菌KM01 在含MnSO4和MnCl2的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中生長時產(chǎn)生沉淀物。KM01 在含0.01 mol/L MnSO4培養(yǎng)液中培養(yǎng)，10 000 r/min 離心15min 后，得到紅色的上清液(圖5–A 左)和黑色沉淀(圖5–A 右)；KM01 在含0.01 mol/L MnCl2培養(yǎng)液中培養(yǎng)，離心后得到淡紅色的上清液(圖5–B 左)和褐色沉淀(圖5–B 右)。將沉淀物用去離子水重懸浮后，加入LBB 試劑，混合液避光放置24 h 后，未呈現(xiàn)陽性反應(yīng)的藍(lán)色，因此，KM01 對Mn2+的氧化作用為陰性結(jié)果，表明菌株KM01 在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的黑褐色沉淀物不含氧化錳，可排除菌株KM01 對Mn2+的氧化能力。菌株KM01 產(chǎn)生含錳沉淀物的機(jī)理可能是：細(xì)菌在生長過程中通過生物吸附作用將Mn2+吸附在細(xì)胞表面，還通過生物積累作用將Mn2+富集到細(xì)胞內(nèi)部吸收利用，因此，單個細(xì)胞的密度增大而容易發(fā)生沉降，最終聚集成富含錳的細(xì)胞沉淀物。

圖5 抗錳菌KM01 在含錳培養(yǎng)液中產(chǎn)生的沉淀物 Fig.5 Precipitate produced after Mn–resistant strain KM01growing in Mn–containing broth

2.6 KM01 對生豬養(yǎng)殖糞污廢水中錳的去除作用

火焰原子吸收光譜法測定結(jié)果表明，生豬養(yǎng)殖糞污廢水原液中Mn2+的含量為0.192 8mg/L。由正交試驗結(jié)果(表2、表3)可知，pH 值、溫度、接種量對錳的去除率依次減小，但3個因素對響應(yīng)變量(錳去除率)的影響無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，錳去除效率最高的因素組合為pH 7、28℃和1%接種量。此試驗條件下，錳去除率為80.5%。

表2 正交試驗結(jié)果 Table 2 Results of the orthogonal experimental design

表3 以錳去除率為響應(yīng)指標(biāo)的正交試驗方差分析結(jié)果 Table 3 Results of analysis of variance for orthogonal experimental design using removal rate of Mn as response factor

接種抗錳菌KM01 之前，生豬養(yǎng)殖糞污廢水原液是具有惡臭的黑褐色有機(jī)廢水；接種抗錳菌KM01 后，廢水的顏色從黑褐色變成淺灰色，色度明顯降低，且惡臭氣味消失。

3 結(jié)論與討論

1) 從湘潭錳礦采集土壤樣本，經(jīng)分離純化，得到1 株抗錳細(xì)菌KM01。該菌在28℃產(chǎn)生紅色素，而在37℃不產(chǎn)色素，結(jié)合16S rDNA序列(KF206118)分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定該菌為一種沙雷氏菌(Serratia sp. KM01)。

2) 抗錳沙雷氏菌KM01 對Mn2+有很強(qiáng)的抗性和吸附沉降能力。28℃時，KM01 在含0～4% MnSO4的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中都能正常生長，所產(chǎn)生的色素隨MnSO4濃度的升高而由紅變黃。KM01 在含MnSO4和MnCl2的培養(yǎng)液中生長，能產(chǎn)生含錳的沉淀物。經(jīng)火焰原子吸收光譜法檢測分析，KM01 在含MnSO4(＜0.015 mol/L)培養(yǎng)液中28℃振蕩培養(yǎng)48 h，錳去除率在89%以上。

3) 將抗錳沙雷氏菌KM01 接種于含Mn2+0.192 8mg/L 的生豬養(yǎng)殖糞污廢水原液中，在pH 7、28℃和1%接種量的試驗條件下，錳去除率為80.5%。

糞污廢水中Mn2+含量(0.192 8mg/L)接近自然湖水水體中 Mn2+含量的上限(0.004 ～0.200mg/L)[9]。直接排放未經(jīng)處理的糞污廢水在農(nóng)村生豬養(yǎng)殖業(yè)中比較常見。時間一長，環(huán)境中的錳就會累積起來 。本試驗中分離的抗錳沙雷氏菌KM01，在相當(dāng)溫和的培養(yǎng)條件(即只需調(diào)整生豬養(yǎng)殖廢水的pH 值至中性)接種培養(yǎng)后即可以使其中的錳去除率達(dá)80%以上，表明抗錳菌KM01 在含錳生豬養(yǎng)殖糞污廢水的除錳處理方面具有應(yīng)用潛力。

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