利用生物酶降解煙草果膠的研究

朱曉蘭，劉百戰(zhàn)，王維妙，高蕓

(1.中國科學技術大學煙草與健康研究中心，安徽 合肥230052；2.上海煙草集團有限責任公司煙草行業(yè)卷煙煙氣重點實驗室，上海200082)

果膠是植物細胞壁所特有的組分，屬于多糖類碳氫化合物[1]。過多的果膠質影響煙葉的彈性和韌性[2]，造成干煙葉糙碎。果膠因親水力強，易使煙葉過度吸濕，造成煙葉的工業(yè)可用性和貯藏的安全性降低。果膠發(fā)酵生成多達1% ～1.5%的乙酸，乙酸有辛辣和刺激味[3]。果膠質在燃吸過程中產(chǎn)生甲醇，甲醇再進一步氧化為甲醛、甲酸，不僅使煙氣具有刺激性，而且不利于吸煙的安全性；較高的果膠質含量還會導致卷煙焦油量升高[4]，因此，對于煙草吸味品質來說，果膠是一種不利的化學成分。

有研究表明，在煙草加工過程中，向煙葉中添加一定量的生物酶，能促使部分細胞壁物質降解為水溶性糖，使得煙葉刺激性雜氣有所降低，從而改善煙葉品質[5–6]。于建軍等[7]用果膠酶處理煙葉，煙葉果膠質含量降低，香氣物質總量提高了29.94%。鞏效偉等[8]利用果膠酶處理煙梗后，細胞壁類物質含量降低，還原糖含量升高，中性致香成分總量明顯提高。筆者利用果膠甲酯酶、果膠裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶、纖維素復合酶4 種生物酶處理煙葉，部分細胞壁物質發(fā)生了降解，采用13C NMR 光譜法研究了降解后果膠的含量和結構(甲酯度、乙酰度及中性糖比例)的變化，并結合煙葉致香成分的分析，試圖從果膠的精細結構上把握果膠的降解，為提高煙葉品質和使用價值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

云南清香型煙葉C3F，取自安徽中煙工業(yè)公司，煙樣于40℃烘箱中干燥4 h后，粉碎備用。

果膠甲酯酶(PE)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠裂解酶(PNL)和纖維素復合酶(CE)，活性為20 000 U/g，購自南京添嘉生物科技有限公司。聚半乳糖醛酸(PGA，99.5%)和四甲基硅烷(98.5%)購自上海百靈威化學品公司；山梨醇內(nèi)標和中性糖標樣購自上海試劑二廠。

主要儀器：AVANCE AV 400 spectrometer超導傅立葉數(shù)字化核磁共振譜儀(瑞士布魯克公司)；Trace ISQ 氣相色譜–質譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher公司，配DB–5MS毛細管色譜柱)；同時蒸餾萃取裝置(中國科學技術大學玻璃儀器廠定制)；S7500超聲波發(fā)生器(廣東必能信超聲有限公司)。

1.2 方法

將PE、PG、PNL和CE用50℃的蒸餾水溶解，配制成5、10、20g/L的單酶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

將云南烤煙C3F煙葉回潮后切絲，每份50g。將質量濃度為5、10、20g/L的酶溶液50mL，裝入小型噴霧器，均勻噴灑于煙絲上。將煙絲裝入2層用水濕潤過的食品包裝袋中，密封，置于調溫調濕箱中(溫度50℃，相對濕度25%)貯存4 h，用于酶解。酶解結束后，迅速將煙絲放入80℃烘箱中，保持20min，使酶在高溫條件下完全失活。以不加酶的蒸餾水作為對照，每個處理重復3次。酶解后的煙絲40℃烘干，研磨成粉末，用于測定果膠含量及結構、纖維素、木質素、常規(guī)化學成分和中性致香成分。

煙葉中的纖維素、半纖維素和木質素含量按照YC/T347—2010 的方法測定。果膠的提取、含量及結構的測定按文獻[9]方法進行。

按YC/T159—2002、YC/T160—2002、YC/T161— 2002、YC/T162—2002、YC/T217—2007 測定煙葉中總糖、總植物堿、總氮、氯離子、鉀離子的含量。

按照文獻[10]方法，采用同時蒸餾萃取和GC/MS 測定煙葉中性致香物質含量。參照文獻[13]和[11]方法進行果膠中性糖的水解和衍生化分析。

2 結果與分析

2.1 酶處理對煙葉細胞壁類物質含量的影響

表1列出了4種酶處理后，煙葉中纖維素和木質素含量、果膠含量及結構的變化。與對照相比，酶處理后的煙葉樣品果膠、纖維素和木質素含量均降低；隨著酶濃度的增大，煙葉中細胞壁類物質的含量呈下降趨勢，當酶質量濃度高于10g/L后，下降趨緩。果膠酶處理后，煙葉果膠含量降幅較大，降低率為4.6% ～17.8%，纖維素含量降低了0.87% ～ 6.7%，木質素降低了2.1% ～9.5%。纖維素酶處理后，煙葉果膠含量降低了1.5% ～4.1%，纖維素含量降低了3.9% ～12.6%，木質素降低了4.9% ～8.6%。纖維素酶是復合酶，在直接降解纖維素，促進纖維素、半纖維素分解的同時，可促進植物細胞壁的溶解，酶處理后煙葉細胞壁受到一定程度的破壞，提高了煙葉中果膠酶和木質素酶與細胞壁物質的作用效果[12]。果膠甲酯酶和果膠裂解酶處理后，煙樣果膠的甲酯度顯著降低；多聚半乳糖醛酸酶處理后，煙葉果膠的甲酯度略有增大；纖維素復合酶處理后，煙葉果膠結構變化不明顯，這主要與不同酶作用的底物不同[13]有關。果膠甲酯酶促進果膠酸酯脫酯降解生成果膠酸，果膠裂解酶也能夠降解高度甲酯化的果膠，因而使果膠的甲酯度降低更明顯。多聚半乳糖醛酸酶促進聚半乳糖醛酸降解為單糖或寡糖，使得果膠酯的比例增大，因此酯化度增大。煙葉樣品中果膠的乙酰度本身含量較低，酶處理后也有下降的趨勢。

表1 酶處理后煙葉纖維素和木質素含量及果膠的甲酯度和乙酰度 Table 1 Contents of cellulose and lignin and degrees of methylation and acetylation of pectin in tobacco treated with enzymes

2.2 酶處理對煙葉常規(guī)化學成分的影響

從表2 中可以看出，與對照相比，酶處理后，煙葉總糖含量增加，且隨酶濃度的增加而增大。煙堿、鉀離子和氯離子含量也有所提高，總氮與對照持平或略有下降。糖含量的升高與細胞壁類物質的降解有關，同時還為美拉德反應提供了反應底物，有利于煙葉的香吃味的形成。糖類物質必須和煙堿、總氮協(xié)調，才能使煙氣豐滿、醇和、吃味甜潤、舒適[14]，從糖堿比、糖氮比和氮堿比來看，酶濃度適中(10g/L)時，處理后的煙葉總糖含量明顯提高，但仍能保持化學成分的協(xié)調性[15]，有利于提高煙葉的使用價值。

表2 酶處理后煙葉的常規(guī)化學成分含量 Table 2 Contents of routine chemical components in tobacco treated with enzymes

2.3 酶處理對果膠中性糖的影響

果膠有3 種結構，HG、RG–Ⅰ和RG–Ⅱ型，主要由以半乳糖醛酸為基本結構的平滑區(qū)和帶有大量中性糖支鏈的半乳糖醛酸和鼠李糖交替連接的毛發(fā)區(qū)組成[16]，在沒有酶催化的情況下，果膠的中性糖支鏈和一些聚合物的糖苷聯(lián)接在提取過程中有輕微的水解，糖醛酸之間和糖醛酸與鼠李糖之間的聯(lián)接是最穩(wěn)定的[17]。表3 結果顯示，經(jīng)酶處理后，果膠的中性糖的含量均比對照高。果膠甲酯酶處理的中性糖增加最多，其次是多聚半乳糖醛酸酶處理，纖維素復合酶處理也使果膠中性糖含量(尤其是葡萄糖)增加。

表3 酶處理后煙葉的果膠中性糖含量 Table 3 Neutral sugar contents in pectin from tobacco treated with enzymes μg/g

圖1為不同酶處理后煙葉果膠樣品的中性糖比例。與對照相比，3種果膠酶處理，阿拉伯糖和半乳糖比例明顯增加，尤其是果膠甲酯酶和果膠裂解酶處理后樣品。因為果膠酶的底物分子是聚半乳糖醛酸和果膠酯，更多的是促進主鏈斷鏈， RG–Ⅰ型結構會相對增大[16]，因此，阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖比例會增大。而纖維素酶不具備專一的底物催化效應，雖然也使細胞壁類物質含量下降，但不能對果膠中性糖比例產(chǎn)生類似效果，反而會使葡萄糖比例增大。

圖1 不同酶處理煙草中酸提取果膠中性糖的比例 Fig.1 Ratios of neutral sugars in acid extracted pectin from tobacco treated with enzymes

2.4 酶處理對中性致香物質含量的影響

2.4.1 對苯丙氨酸轉化產(chǎn)物含量的影響

從表4可以看出，與對照相比，經(jīng)過酶處理的煙葉的苯丙氨酸轉化產(chǎn)物含量均有不同程度的提高，以質量濃度為20g/L的果膠裂解酶處理增加幅度最大，為56.0%，苯甲醇和苯乙醛的含量分別增加了60.4%和64.1%。

表4 酶處理后煙葉苯丙氨酸轉化產(chǎn)物的含量 Table 4 Contents of phenylalanine degradation products in tobacco treated with enzymes μg/g

表4 (續(xù)) μg/g

2.4.2 對棕色化反應產(chǎn)物含量的影響

由表5看出，經(jīng)過酶處理的煙葉，棕色化反應產(chǎn)物(主要是糠醛和糠醇)均有明顯提高，其中以纖維素復合酶和多聚半乳糖醛酸酶處理增幅較大，在酶質量濃度為20g/L時增幅分別為43.3%和35.6%，果膠甲酯酶和果膠裂解酶處理樣品的棕色化反應產(chǎn)物糠醛增幅較小。

表5 酶處理后煙葉棕色化反應產(chǎn)物的含量 Table 5 Content of maillard reaction products in tobacco treated with enzymes μg/g

2.4.3 對類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量的影響

從表6看出，酶處理后，大部分類胡蘿卜素降解產(chǎn)物比對照有所提高，尤其是β–大馬酮、β–二氫大馬酮和香葉基丙酮含量提高較多。多聚半乳糖醛酸酶和果膠甲酯酶處理，煙葉的類胡蘿卜素降解產(chǎn)物總含量與對照相近，而果膠裂解酶和纖維素復合酶處理的樣品明顯增加，在酶質量濃度為20g/L時，增幅分別為21.4%和16.9%。

表6 酶處理后煙葉類胡蘿卜素降解產(chǎn)物的含量 Table 6 Content of carotenoid degradation products in tobacco treated with enzymes μg/g

2.4.4 對新植二烯含量和中性致香物質總量的影響

結果顯示，多聚半乳糖醛酸酶和果膠甲酯酶處理的樣品的新植二烯含量分別為84.79和87.53μg/g與對照(90.93μg/g)相比略有降低，果膠裂解酶處理樣品的新植二烯含量(96.56μg/g)略有增加，纖維素復合酶處理樣品的新植二烯含量與對照相比有較大增加，在酶質量濃度為20g/L時增幅為56.4%，說明纖維素酶處理比果膠酶處理更能增加煙葉的新植二烯含量。

對中性致香物質總量(不含新植二烯)的分析表明，與對照(87.57μg/g)相比，多聚半乳糖醛酸酶和果膠甲酯酶處理樣含量(分別為94.89和89.99μg/g)略有增加，而果膠裂解酶和纖維素復合酶處理煙葉含量比對照有較大幅度提高，在酶濃度為20g/L時增幅分別為24.4%和21.9%。

3 結論

采用13C NMR光譜法研究4種酶制劑降解煙葉后果膠含量及結構變化，結果表明：添加果膠酶或纖維素酶都可以有效降解煙葉中的果膠、纖維素和木質素。不同種類酶對果膠的結構變化的影響有所不同，果膠甲酯酶和果膠裂解酶處理樣品均使果膠的甲酯度降低，多聚半乳糖醛酸酶處理后，果膠的甲酯度略有增大，纖維素復合酶處理變化不明顯。酶處理后果膠中性糖的含量均比對照樣有所增加，其中果膠甲酯酶處理增加最大，但不同種類酶處理的中性糖比例有區(qū)別，果膠酶處理后阿拉伯糖和半乳糖比例明顯增加，而纖維素酶處理后葡萄糖比例增加較多。

對中性致香物質的分析表明，所有酶處理均使苯丙氨酸轉化產(chǎn)物和棕色化反應產(chǎn)物含量呈增加趨勢，但類胡蘿卜素降解產(chǎn)物和新植二烯含量經(jīng)多聚半乳糖醛酸酶和果膠甲酯酶處理略有降低或持平，而果膠裂解酶和纖維素酶處理后則呈增加趨勢，其中性香氣物質總量(不含新植二烯)分別提高了24.4%和21.9%。據(jù)任曉紅等[2]報道，煙葉中果膠的含量與中性香氣物質和一些香氣前體物質含量呈負相關，本試驗中酶處理使煙葉果膠含量下降，中性致香物質的總含量增加，與任曉紅等的研究結論相一致。

[1] Ha M A，Vietor R J，Jardine G D，et al．Conformation and mobility of the arabinan andgalactanside-chains of pectin[J]．Phychemistry，2005，66(15)：1817–1824．

[ 2] 任曉紅，陳剛，馬海燕，等．烤煙細胞壁物質對煙葉質量影響研究[J]．中國農(nóng)學通報，2010，26(4)：113–116．

[3] Georgiev Y，Ognyanov M，Yanakieva I，et al．Isolation，characterization and modification of citrus pectins[J]．J BioScience Biotechnology，2012，1(3)：223–233．

[4] 饒巍，庹蘇行，鐘科軍，等．煙草果膠的提取分析研究進展[J]．廣州化學，2009，34(1)：71–76．

[5] Husson E，Buchoux S，Avondo C，et al．Enzymatic hydrolysis of ionic liquid-pretreated celluloses ：Contribution of CP–MAS 13C NMR and SEM[J]. Bioresource Technology，2011，102(15)：7335–7342．

[6] 肖瑞云，林凱．不同復合酶對煙梗化學成分和感官評吸的影響[J]．江西農(nóng)業(yè)學報，2010，22(10)：70–72．

[7] 于建軍，馬海燕，楊寒文，等．利用果膠酶降解煙葉中果膠的研究[J]．江西農(nóng)業(yè)學報，2009，21(3)：136–138．

[8] 鞏效偉，陳興，申曉鋒，等．利用果膠酶改善煙梗內(nèi)在品質的研究[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學，2013，41(15)：6889–6891．

[9] Zhu X，Liu B，Zheng S，et al．Quantitative and structure analysis of pectin in tobacco by13C CP/MAS NMR spectroscopy [J]．Anal Methods，2014，6(8)：6407–6413．

[10] Peng F，Sheng L，Liu B，et al．Comparison of different extraction methods：Steam distillation，simultaneous distillation and extraction and headspace co-distillation，used for the analysis of the volatile components in aged flue-cured tobacco leaves[J]．Journal of Chromatography A，2004，1040(1)：1–17．

[11] 杜啟云，何海娟．卷煙中非揮發(fā)性有機酸、糖類、某些氨基酸和磷酸的同時測定[J]．煙草科技，2007(7)：30–35．

[12] Mori T，Chikayama，E，TsuboiY，et al．Exploring the conformational space of amorphous cellulose using NMR chemical shifts[J]．Carbohydrate Polymers，2012，90：1197–1203．

[13] 李立恒，謝達平，蘭時樂．環(huán)狀芽孢桿菌A6 產(chǎn)生的果膠酶和木聚糖酶分離純化及酶學性質[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學版，2007，33(6)：667–671．

[14] 楊麗麗，鄧小華，鄧井青，等．湘南稻田濃香型烤煙適宜采收成熟度研究[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學版，2014，40(3)：236–240．

[15] 李國棟，馬海燕，于建軍，等．纖維素酶降解煙葉中纖維素的作用效果[J]．中國農(nóng)學通報，2008，24(12)：256–259．

[16] Willats W G T，Knox J P，Mikkelsen J D．Pectin：New insights into an old polymer are starting togel[J]．Trends in Food Science & Technology，2006，17(3)：97–104．

[17] Garna H，Mabon N，Wathelet B，et al．New method for a two step hydrolysis and chromatographic analysis of pectin neutral sugar chains [J]．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52(15)：4652–4659．