大蒜素對大鼠心肌缺血的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制研究

展宏剛,孫淑娟,梁孝印,程梅

(1.山東省泰山療養(yǎng)院 藥劑科，山東 泰安 271000；2.山東省千佛山醫(yī)院 藥劑科，山東 濟(jì)南 250014；3.泰安市中心醫(yī)院，山東 泰安 271000；4.山東大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系，山東 濟(jì)南 250100)

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大蒜素對大鼠心肌缺血的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制研究

展宏剛1,孫淑娟2Δ,梁孝印3,程梅4

(1.山東省泰山療養(yǎng)院 藥劑科，山東 泰安 271000；2.山東省千佛山醫(yī)院 藥劑科，山東 濟(jì)南 250014；3.泰安市中心醫(yī)院，山東 泰安 271000；4.山東大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系，山東 濟(jì)南 250100)

目的 探究大蒜素對大鼠心肌缺血的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。方法 將50只準(zhǔn)性SD大鼠隨機(jī)平均分成假手術(shù)組(SO組)，缺血/再灌注組(I/R組)，大蒜素處理組高劑量組(HA組)、中劑量組(MA組)、低劑量組(LA組)，每組10只。大蒜素處理組分別灌胃給予100、50、25 mg/(kg·d)大蒜素，給藥20 d后構(gòu)建大鼠心肌缺血/再灌注模型。檢測各組大鼠血清及缺血心肌組織肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含量；Tunel法檢測各組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡情況；免疫印跡法檢測天冬氨酸蛋白水解酶-3(aspartic protease -3，caspase-3)，磷酸化分裂原激活的蛋白激酶(phosphorylation of mitogen activated protein kinase，p-p38MAPK)及分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)的表達(dá)情況。結(jié)果 HA組與MA組的CK-MB、MDA水平均比I/R組顯著偏低(P<0.05)，HA組的SOD水平較I/R組顯著偏高(P=0.015)。HA組，MA組的心肌損傷范圍及凋亡指數(shù)較I/R組顯著偏低(P<0.05)，HA組caspase-3蛋白表達(dá)水平較I/R組顯著偏低(P=0.023)。5組p38MAPK蛋白表達(dá)量無顯著差異，但是HA組p-p38MAPK蛋白表達(dá)量較I/R組顯著偏高(P=0.038)。結(jié)論 大蒜素對大鼠心肌缺血具有明顯的保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用可能與心肌凋亡的抑制作用及p38蛋白的活化具有一定關(guān)系。

大蒜素；心肌缺血； 凋亡； I/R；p38MAPK；

大蒜素是從百合科蔥屬植物大蒜的鱗莖中提取的一種有機(jī)硫化合物[1]，學(xué)名為二烯丙基硫代亞磺酸酯。目前有不少文獻(xiàn)報道顯示大蒜素可以調(diào)節(jié)血脂水平，改善心血管彈性[2]，且對于心肌缺血可能具有一定的保護(hù)作用[3]。大蒜素對于心肌缺血的保護(hù)可能是通過延緩心肌細(xì)胞凋亡，提高心肌細(xì)胞缺氧耐受，促進(jìn)受損心肌細(xì)胞的自我修復(fù)等方式來實現(xiàn)的[4-5]，但是對于其發(fā)揮心肌缺血的保護(hù)作用及機(jī)制仍不明確。本研究通過給予大鼠不同大蒜素劑量處理并構(gòu)建心肌缺血再灌注模型，以期為進(jìn)一步研究大蒜素心肌保護(hù)作用的具體機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級SD雌性大鼠50只，體質(zhì)量250～300 g，2月齡，本院動物實驗中心提供，許可證號：醫(yī)動字9-7-3，實驗遵循《實驗動物保護(hù)條例》。

1.1.2 藥物與試劑：大蒜素(長沙睿鼎生物科技有限公司，100384-200501)；天冬氨酸蛋白水解酶-3抗體(caspase-3，武漢博士德生物工程公司)；分裂原激活的蛋白激酶抗體(mitogen activated protein kinase，p38MAPK，武漢博士德生物工程公司)，磷酸化分裂原激活的蛋白激酶(phosphorylation of mitogen activated protein kinase，p-p38MAPK，武漢博士德生物工程公司)，肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)檢測試劑盒(南京建成生物工程公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程公司)；熒光標(biāo)記山羊抗小鼠二抗 (武漢博士德生物工程公司)。

1.1.3 儀器：蛋白質(zhì)電泳凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；蛋白質(zhì)電泳儀Power/PAC 200(Bio-Rad)；HITACHI 7020全自動生化儀(日本日立公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及處理：50只清潔級雌性SD大鼠平均分為5組，每組10只。假手術(shù)組(sham operation，SO)，前期不做任何處理，20 d后在手術(shù)時只進(jìn)行穿線，但不結(jié)扎，維持150 min后處死；缺血/再灌注組(ischemia /reperfusion，I/R)前期不做任何處理，20 d后直接構(gòu)建大鼠心肌缺血/再灌注模型；高劑量大蒜素組(high dose allicin，HA)，建模前以灌胃方式給藥100 mg/(kg·d)連續(xù)給藥20d后構(gòu)建缺血/再灌注模型；中劑量大蒜素組(middle dose allicin，MA)，建模前以灌胃方式給藥50 mg/(kg·d)，連續(xù)給藥20 d后構(gòu)建缺血/再灌注模型；低劑量大蒜素組(low dose allicin，LA)，以灌胃方式給藥25 mg/(kg·d)，連續(xù)給藥20 d后構(gòu)建缺血/再灌注模型。

1.2.2 大鼠心肌缺血/再灌注模型構(gòu)建：SD大鼠麻醉后手術(shù)切開氣管，用呼吸機(jī)維持80～90次/分的呼吸頻率。開胸后在肺動脈圓錐右緣、平左心耳間冠狀靜脈走行處下緣1～2 mm淺層心肌進(jìn)行縫線，在順血管的心臟表面墊一橡膠硬管，然后連同硬管一同結(jié)扎，通過夾閉套管夾造成冠狀動脈阻塞。閉塞30 min后恢復(fù)血流2 h，從而構(gòu)建出心臟缺血/再灌注模型。以心電圖T波高聳或者ST段明顯抬高作為冠狀動脈結(jié)扎成功的標(biāo)志，提升的ST段回落到原來的1/2以下作為冠狀動脈恢復(fù)血液灌注的標(biāo)志。

1.2.3 大鼠心肌缺血和梗死范圍確定：每組10只大鼠在灌注結(jié)束后，對冠狀動脈進(jìn)行結(jié)扎，然后從左心室注入3% Evans藍(lán)染液3 mL，標(biāo)記缺血心肌與未缺血心肌(未缺血心肌呈現(xiàn)藍(lán)色，缺血心肌呈現(xiàn)白色)。在標(biāo)記出缺血心肌后，將離體心臟置于-70 ℃下保存0.5 h，分離缺血心肌和未缺血心肌。將缺血的心肌以平行房室溝的方向進(jìn)行切片，然后放入1%氯化三苯基四氮唑硝酸緩沖液(pH=7.4)中室溫水浴0.5 h，梗死區(qū)未染色，非梗死區(qū)染為紅色，紅色區(qū)與未染色區(qū)之和為缺血區(qū)，計算梗死面積(infarct size，IS)與缺血區(qū)面積(area at risk，AAR)的比值(%，IS/ARR)。

1.2.4 大鼠心肌受損指標(biāo)檢測：大鼠缺血再灌注后采用注射器心臟取抗凝血2 mL，10000 r/min,離心5 min，獲得大鼠血清并用全自動生化儀(HITACHI 7020)測定各組CK-MB含量；另取缺血周圍區(qū)心肌組織在低溫環(huán)境下研磨后制成組織勻漿,用硫代巴比妥酸法測定各組MDA含量，用黃嘌呤氧化酶法測定SOD含量。

1.2.5 大鼠心肌細(xì)胞凋亡檢測：大鼠灌注后摘取心臟，制備心肌石蠟標(biāo)本，采用TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞。將石蠟切片用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗3×5 min，浸入細(xì)胞膜通透液中冰浴放置2 min，轉(zhuǎn)入按照TUNEL試劑盒(碧云天)配制好的染色液中37 ℃孵育60 min，PBS洗滌3次。用抗熒光淬滅液封片后鏡下觀察，在缺血區(qū)隨機(jī)取5個高倍鏡視野，計數(shù)細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，計算凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.6 Caspase-3，p38MAPK，p-p38MAPK蛋白檢測：采用免疫印跡法檢測心肌中caspase-3，p38MAPK，p-p38MAPK蛋白的表達(dá)情況。心肌缺血再灌注后取下大鼠心臟，切出直徑5 mm大小的心肌塊，加入500 μL的RIPA細(xì)胞裂解液和1%蛋白酶抑制劑(PMSF)，用勻漿攪拌器攪拌5 min，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)離心取上清。采用Bradford法測定蛋白濃度，計算上樣量后將蛋白變性，上樣電泳。于300 mA恒流1 h轉(zhuǎn)膜至NC膜，將NC膜取出用含5%脫脂奶粉的PBS于37 ℃封閉2 h，將一抗按照相應(yīng)倍數(shù)稀釋后37 ℃孵育2 h，用含有5% Tween20的PBST經(jīng)6×5 min洗膜，將辣根化物標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗稀釋2000倍后孵育NC膜1 h后，用含5% Tween20的PBST洗膜6×5 min。用顯色液曝光條帶，用Quantity one軟件分析條帶光密度分值，以SO組為100%，計算其他組與SO組的光密度相對值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的生化指標(biāo)檢測 各組大鼠在處理后血清中的生化指標(biāo)檢測結(jié)果見表1。血清CK-MB檢測結(jié)果顯示，I/R、HA、MA、LA 4組大鼠血清CK-MB濃度相比SO組顯著偏高(P<0.05)，而HA、MA組大鼠的血清CK-MB濃度較I/R組顯著偏低(P<0.05)。血清MDA檢測結(jié)果顯示，I/R、MA、LA 3組大鼠血清MDA水平較SO組顯著偏高(P<0.05)，而HA、MA組血清MDA水平則相比I/R組顯著偏低(P<0.05)。血清SOD檢測結(jié)果顯示，I/R、MA、LA 3組大鼠血清SOD水平較SO組偏低(P<0.05)，而HA組則較I/R組偏高(P<0.05)。

表1 各組大鼠心肌受損相關(guān)生化指標(biāo)比較±s)

*P<0.05，與SO組比較，compared with SO group；#P<0.05，與I/R組比較，compared with I/R group

2.2 各組大鼠心肌損傷范圍及凋亡情況 各組大鼠心肌IS/ARR比值，凋亡情況及caspase-3蛋白表達(dá)情況見2。HA、MA組的心肌IS/AAR比值比I/R組顯著偏小(P<0.05)，且隨著給藥劑量的升高，IS/AAR比值依次變小。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示I/R、HA、MA、LA 4組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均比SO組顯著升高(P<0.05)，而HA、MA 、LA 3組的細(xì)胞凋亡指數(shù)比I/R組顯著偏低(P<0.05)。各組大鼠caspase-3免疫印跡結(jié)果顯示I/R、MA、LA 3組大鼠的caspase-3表達(dá)量比SO組顯著偏高(P<0.05)，而HA組caspase-3表達(dá)量較I/R組顯著偏低(P<0.05)。

表2 各組大鼠心肌IS/ARR比值、AI及caspase-3表達(dá)比較

*P<0.05，與SO組比較，compared with SO group；#P<0.05，與I/R組比較，compared with I/R group

2.3 各組大鼠p-p38MAPK及p38MAPK表達(dá)情況 各組大鼠心肌p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平見圖1。5組大鼠心肌p38MAPK蛋白的表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HA、MA、LA組p-p38MAPK蛋白的表達(dá)量相對SO組顯著升高(P<0.05),且HA、MA組p-p38MAPK蛋白表達(dá)量相對于I/R組也顯著升高(P<0.05)。

圖1 各組大鼠心肌p38MAPK和p-p38MAPK表達(dá)量比較*P<0.05，與SO組比較；#P<0.05，與I/R組比較Fig.1 Comparison the expression of rats myocardial p38MAPK and p-p38MAPK in each group*P<0.05, compared with SO group; #P<0.05, compared with I/R group

3 討論

大蒜素作為一種具有軟化血管[7]，降低血脂[8]，抗擊腫瘤[9]，殺菌消炎[10]等功效的天然植物提取藥物，近年來已經(jīng)成為相關(guān)疾病治療的研究熱點。Li等[11]通過構(gòu)建缺血/再灌注模型證實大蒜素具有心肌保護(hù)作用，史春志等[12]研究表明大蒜素可能通過調(diào)控細(xì)胞凋亡，提高心肌細(xì)胞耐受性發(fā)揮保護(hù)作用。由于p38MAPK信號通路在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[13]，因而研究推測大蒜素的心肌保護(hù)作用可能與p38MAPK信號通路有關(guān)。本研究通過構(gòu)建大鼠心肌缺血/再灌注模型，探究大蒜素對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。

由大鼠心肌梗死范圍結(jié)果可以看出，經(jīng)過大蒜素給藥的大鼠，在構(gòu)建缺血/再灌注模型之后其心肌梗死的情況要明顯好于缺血/再灌注組，而且給藥劑量的提升，其梗死部分占缺血組織的百分比明顯降低。在大鼠缺血/再灌注模型的血生化指標(biāo)中大蒜素組的CK-MB和MDA含量相比缺血/再灌注組都明顯偏低，且具有劑量依賴性，而缺血/再灌注組的SOD含量則相對大蒜素組和假手術(shù)組明顯偏低。這些實驗結(jié)果均顯示了大蒜素對于心肌缺血具有較好的保護(hù)作用，而且在一定劑量范圍內(nèi)，其保護(hù)效果與給藥劑量時成正比的關(guān)系。

通過各組大鼠心肌細(xì)胞的凋亡檢測，研究表明，同等觀察條件下各組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)分由多到少依次為缺血/再灌注組、低劑量大蒜素組、中劑量大蒜素組、高劑量大蒜素組、假手術(shù)組。而通過免疫印跡檢測出各組大鼠心肌中caspase-3的表達(dá)量也是隨著大蒜素劑量的增加而逐漸降低。Caspase-3作為細(xì)胞凋亡過程的終末剪切酶，其表達(dá)量的多少反映著細(xì)胞凋亡的程度，而心肌細(xì)胞凋亡又是心肌梗死的一種方式。所以上述結(jié)果表明大蒜素對于心肌細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用。

免疫印跡法檢測p-p38MAPK蛋白和p38MAPK蛋白的結(jié)果顯示，隨著大蒜素劑量的增加，心肌組織中p-p38MAPK蛋白的表達(dá)顯著性增加，而各組心肌中總p38MAPK含量并無顯著差異。該結(jié)果表明，大蒜素對于p38MAPK的磷酸化具有一定的積極作用。p38MAPK信號通路是近年來研究較多的信號通路之一，其在細(xì)胞凋亡中具有重要的作用[14-15]。其上游信號通路中存在有PKC-TGF-β1-p38MAPK的激活機(jī)制，且有研究顯示，大蒜素作用于細(xì)胞中可能引起蛋白激酶C(PKC)通路的活化[16-17]，這為后續(xù)研究大蒜素延緩心肌細(xì)胞凋亡和對心肌缺血/再灌注的具體原理提供了思路。

總之，本研究證實了大蒜素對于大鼠心肌缺血具有一定的保護(hù)作用，且對于心肌受損后的細(xì)胞凋亡也有較好的抑制作用。大蒜素對于大鼠心肌缺血的保護(hù)作用可能與心肌凋亡的抑制作用及p38蛋白的活化具有一定關(guān)系，其具體機(jī)制可在將來進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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(編校：吳茜)

Protective effects of allicin on myocardial ischemia in rats and related mechanisms

ZHAN Hong-gang1,SUN Shu-juan2Δ,LIANG Xiao-yin3,CHENG Mei4

(1.Department of Pharmacy, Taishan Sanatorium of Shandong Province, Taian 271000, China; 2.Department of Pharmacy,Qianfoshan Hospital of Shandong Province, Jinan 250014, China; 3.Taian Municipal Central Hospital, Taian 271000,China; 4.Department of Clinical Medicine, Shandong University, Jinan 250100, China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of allicin on myocardial ischemia in rats and related mechanisms.Methods50 SD rats were randomly divided into sham operation group (SO group), ischemia/reperfusion group (I/R group), allicin treatment groups: high dose allicin group (HA group), middle dose allicin group (MA group), low dose allicin group (LA group), 10 rats in each group.100, 50, 25 mg/(kg·d) allicin were administered into rats in allicin treatment groups for 20 days, respectively.All groups except SO group were constructed of myocardial ischemia/reperfusion (I/R) model.Serum and ischemic myocardial tissue were obtained to examine creatine kinase-MB (CK-MB), malondialdehyde (MDA), and superoxide dismutase (SOD) by the corresponding kit; cardiac tissue were used to detect damage extents and cell apoptosis by Tunel method; myocardial protein was extracted and the expression of aspartic protease-3(caspase-3), phosphorylation of mitogen activated protein kinase (p-p38MAPK) and mitogen-activated protein kinase (p38MAPK) were detected by Western blot.ResultsLevels of CK-MB and MDA in HA group and MA group were lower than I/R group (P<0.05), and level of SOD was higher (P=0.015).Myocardial injury extent and apoptosis index in HA group and MA group were smaller than that in I/R group (P<0.05).Caspase-3 protein expression level in HA group was lower than that in I/R group (P=0.023).No significant difference was detected among the five groups in p38MAPK protein expression, but HA group p-p38MAPK protein expression level was significantly higher than I/R group (P=0.038). ConclusionAllicin has a significant protective effect on myocardial ischemia, and may have some relationship with the inhibition of myocardial apoptosis and p38 MAPK activation.

allicin; myocardial ischemia; apoptosis; I/R; p38MAPK

2008年度山東省自然科學(xué)基金項目(Y2008C100)

展宏剛，男，本科，主管藥師，研究方向：老年人合理用藥，E-mail：zhhgang@126.com；孫淑娟，通訊作者，女，博士，主任藥師，研究方向：抗真菌耐藥方法與機(jī)制研究，E-mail：sunshujuan888@163.com。

R285.5

A

1005-1678(2015)01-0074-04