葛根素對α-葡萄糖苷酶抑制作用機理的探討

徐婷,褚江洪,丁萍英,倪連松

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺州醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 臨海 317000)

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葛根素對α-葡萄糖苷酶抑制作用機理的探討

徐婷,褚江洪,丁萍英,倪連松Δ

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺州醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 臨海 317000)

目的 探討葛根素對α-葡萄糖苷酶的抑制作用機理。方法 取40只雄性小鼠，分為5組：對照組、阿卡波糖對照組、葛根素(2.5、5.0、10)μM，每組8只，采用酶抑制動力學(xué)方法，研究葛根素對α-葡萄糖苷酶的抑制作用和抑制動力學(xué)，并用分光光度計測定葛根素對小鼠血糖含量變化的影響。結(jié)果 葛根素是一種可逆的競爭型α-葡萄糖苷酶抑制劑 [半抑制濃度IC50為(4.32±0.42)μM]，抑制常數(shù)Ki為(0.41± 0.09)μM；與陽性對照阿卡波糖對比，葛根素能夠明顯的抑制大鼠血糖水平的增長。結(jié)論 葛根素作為一個α-葡萄糖苷酶抑制劑，誘導(dǎo)了酶活性的降低，對調(diào)節(jié)血糖水平起到重要作用，為臨床降血糖提供了理論基礎(chǔ)。

葛根素；α-葡萄糖苷酶；抑制作用；血糖水平；糖尿病

糖尿病類型主要有兩種：1型糖尿病和2型糖尿病，它們所引起癥狀幾乎是相同的[1]，但是所引起疾病的病理卻是有所差別的[2]。α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)種類繁多，性質(zhì)各異，廣泛的分布在生物體內(nèi)，它可以從低聚糖類的非還原末端切開α-1,4糖苷鍵，釋放出葡萄糖[3]，在人類的正常糖類代謝和機體功能方面起到了重要的生理作用，但是當(dāng)人體內(nèi)血糖過高時，可以通過抑制α-glucosidase的活性來降低血糖的含量[4]，起到治療糖尿病及其并發(fā)癥的效果，因此，在醫(yī)藥行業(yè)中α-glucosidase抑制劑被廣泛用于預(yù)防和治療糖尿病、高血脂等疾?。?/p>

葛根素(puerarin)亦稱葛根黃素，是從中藥葛根中分離的具有擴冠作用的異黃酮類衍生物，存在于豆科植物葛及野葛的根，具有退熱、鎮(zhèn)靜和使冠狀動脈血流量增加的作用。有大量文獻表明，葛根素具有降低血糖的作用，但其作用機制以及活性組分的詳情尚不清楚。本課題葛根素為抑制劑，通過體外酶抑制實驗并系統(tǒng)深入研究了其對α-glucosidase的相關(guān)抑制動力學(xué)，并通過對灌胃的小鼠血糖值的抑制作用研究，最終獲取葛根素對α-glucosidase的抑制機理，以期為其在降血糖醫(yī)藥領(lǐng)域的更有效應(yīng)用提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 將禁食16 h的雄性小鼠40只(上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，許可證號:SGXK(滬)2013-0010)，分為5組，每組8只，(第一組為對照組，第二組為阿卡波糖對照組，第3組～第5組為葛根素的3個濃度組)。

1.2 儀器與試劑 UV-2450紫外、可見分光光度計(日本島津公司)；pHs-3C型酸度計(上海雷磁儀器廠)；Millipore Simplicity水純化系統(tǒng)(法國密理博公司)；血糖測定試劑盒(蘭州生物化學(xué)試劑公司)。

α-葡萄糖苷酶從面包酵母中得到(上海TCI公司)，其標(biāo)準(zhǔn)溶液用pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液進行配制；對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)、阿卡波糖(Sigma公司)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液進行配制；葛根素(阿拉丁試劑有限公司)；其他試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.3 實驗方法

1.3.1 葛根素對α-glucosidase的抑制作用：α-glucosidase活性的測定參考Ohta[5]的方法，α-glucosidase催化pNPG產(chǎn)生對硝基苯酚(在處有特征吸收峰)，因此本研究利用UV-2450紫外分光光度計的動力學(xué)/時間軟件測定在405 nm處的紫外吸收(酶催化pNPG生成對硝基苯酚)，在37 ℃下，pH 7.0的磷酸鹽(0.5 mM)緩沖體系中，α-glucosidase(1.0 μM)和不同濃度的葛根素孵化3 h，加pNPG(0.5 mM)后，每隔30 s在405 nm處測定吸光值的變化，并通過下列關(guān)系式對α-glucosidase活性進行評估活性抑制測定重復(fù)3次。抑制率(%)=[ΔAbs540(空白)-ΔAbs540(樣品)/ΔAbs540(空白)]×100%。

1.3.2 葛根素對α-glucosidase的抑制動力學(xué)研究：在上述實驗條件下，固定α-glucosidase的濃度，測定不同葛根素濃度條件下，底物濃度對α-glucosidase催化速率的影響，根據(jù)Lineweaver Burk雙倒數(shù)圖，計算并評估葛根素對α-glucosidase的抑制作用類型，最終求出抑制常數(shù)Ki抑制動力學(xué)實驗重復(fù)3次。

1.3.3 葛根素對小鼠血糖含量的影響：對照組：用灌胃器吸取0.1～0.2 mL suerose (2 g/kg)溶液灌入第一組小鼠的胃中，15 min后再灌入同樣體積的雙重蒸餾水，之后從灌入雙重蒸餾水以后開始計時，分別在30，60，120 min時以斷尾取血的方法對小鼠的血糖值進行測定。第2組～第5組將對照組中的雙重蒸餾水分別替換為阿卡波糖(10 μM)，葛根素(2.5, 5.0, 10 μM)，其他組份不變。測定血糖時，將每組每只小鼠不同的時間點都需進行編號，并將血液收集在離心管中，然后進行離心3000 r/min，時間為15～20 min左右，最后收集管中上層的血清，用分光光度計進行比色測定血糖含量測定重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 葛根素對α-glucosidase的抑制活性 圖1為葛根素的分子結(jié)構(gòu)式。圖2顯示，隨著葛根素濃度的增加(0～20 μM)，抑制率在不斷升高，隨著葛根素的濃度達繼續(xù)增加，對α-glucosidase的抑制能力的趨于平緩，解析其半數(shù)抑制濃度(IC50)為(4.32±0.42)μM，與陽性對照阿卡波糖(IC50)為(18.12±1.15)μM相比，葛根素對α-glucosidase的半抑制濃度低于陽性對照阿卡波糖，表現(xiàn)出了良好的α-glucosidase抑制活性。

圖1 葛根素的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of puerarin

圖2 葛根素抑制α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of puerarin on α-glucosidase

2.2 葛根素對α-glucosidase抑制動力學(xué)研究 通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程作圖，求得和比較酶催化反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)表觀米氏常數(shù)(Kmapp)和最大反應(yīng)速率(Vmax)，Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖 (圖3)是相交于縱坐標(biāo)的一組直線，這表明體系中Vmax保持不變，而Kmapp逐漸增大，這是典型的競爭性抑制作用類型[6]。這表明葛根素可能會結(jié)合到α-glucosidase的活性中心區(qū)域并與周圍的氨基酸殘基發(fā)生相互作用，一方面會與底物競爭活性位點，另一面會誘導(dǎo)酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化是酶自身的催化活性降低。在此基礎(chǔ)上，通過二級曲線方程，求得抑制常數(shù)Ki=(0.41± 0.09)μM。

圖3 葛根素抑制α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲線Fig.3 Lineweaver-Burk plot for inhibition of puerarin on α-glucosidasec(葛根素)/(μM), 從下向上：0, 2.5, 5.0, 10.(n=3).

圖4 葛根素對血糖水平增長的抑制作用Fig.4 The inhibition of puerarin on the increase of blood glucose levels

2.3 葛根素對小鼠血糖含量的影響 結(jié)果顯示，用蔗糖灌胃后的小鼠再用葛根素灌胃，由圖4可以看出，葛根素對抑制血糖值的升高方面有顯著的劑量依賴性，在對照組中，當(dāng)加入蔗糖后，血糖值由74.66 mg/dL升高到179.54 mg/dL，而隨后又降了下來，在葛根素和陽性對照這四組中，在給藥后30 min，小鼠的血糖值與對照組相比都出現(xiàn)了明顯的降低，葛根素(5 μM)與阿卡波糖(10 μM)表現(xiàn)出了相當(dāng)抑制作用。

3 討論

體內(nèi)胰島素分泌不足所導(dǎo)致的一系列臨床綜合癥稱之為糖尿病，這是一種與遺傳基因有著非常密切的疾病。多飲、多尿、多食和體重下降(三多一少)為糖尿病的主要臨床表現(xiàn)，此外其病理檢測手段主要是依據(jù)血糖高、尿液中含有葡萄糖等現(xiàn)象，而糖尿病所引起的并發(fā)癥[7-9]給人們的生理和心理上都造成了巨大的傷害，故安全，有效的降血糖藥物的開發(fā)越來越受到專家和學(xué)者的重視。糖尿病的的主要類型分為:1型和2型兩種，1型糖尿病始于體內(nèi)胰腺中胰島β-細胞產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)，黃酮類物質(zhì)能改善這類糖尿病的病癥，此外，黃酮類物質(zhì)還能通過許多途徑激發(fā)出弱的胰島素效應(yīng)，比如影響磷酸蛋白激酶，α-glucosidase來降低血糖的活性。本研究可以初步推測：在降血糖方面，黃酮發(fā)揮了主要作用，在8種黃酮中，7種黃酮具有α-glucosidase抑制活性。

目前，Acarbose是常用于臨床輔助治療的α-glucosidase抑制劑，但是它會對人體產(chǎn)生很強的毒副作用[1]，故不能被全部人群所接受，而新的化學(xué)合成藥物需要的步驟較繁瑣、毒性大和效率低等弊端顯著，這就使得開發(fā)出具有低毒性、來源于藥用植物的新型α-glucosidase抑制劑迫在眉睫，而且這也是迫切需要和亟需解決的問題。多種中草藥的提取液中進行α-glucosidase活性的抑制實驗結(jié)果表明，五味子、桑葉、大黃、虎杖等[10-11]對α-glucosidase具有良好的抑制效果；食品中含有很多功能性因子具有降血糖的功能，研究發(fā)現(xiàn)，豆制品包括豆鼓和腐乳等對α-glucosidase有較強的抑制活性[12]，這可能是由于豆制品自身的降血糖功能因子和微生物發(fā)酵物[13]共同對α-glucosidase抑制的結(jié)果。Kwon等[14]研究了8種茄子提取物對α-glucosidase活性的抑制作用，研究發(fā)現(xiàn)，茄子中酚類分子的含量會直接影響到α-glucosidase活性的抑制大小。此外，烏龍茶、沙丁魚活性多肽以及食品添加劑D-木糖都對α-glucosidase具有良好的抑制作用。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，葛根素表現(xiàn)出了良好的α-glucosidase抑制效果，且這種抑制作用具有濃度依賴性，隨后的動物實驗發(fā)現(xiàn)，葛根素能夠顯著的降低飯后小鼠的血糖，這很可能是由于黃酮類化合物的構(gòu)效效應(yīng)引起的；此外葛根素具有多種藥理活性，且其低毒性的特點對引起人體的的副作用的概率大大降低，很值得臨床推廣。

國內(nèi)外研究表明[15-16]，抑制劑對相關(guān)疾病有關(guān)的酶的抑制作用呈現(xiàn)可逆的競爭性作用時，這時可以根據(jù)酶活性的高低，通過有效的控制抑制劑藥物的劑量，來高選擇性、可逆的降低酶的活性，而不是使酶徹底的失活，而引起其他不良反應(yīng)，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)葛根素是典型的競爭性抑制劑，這表明葛根素會以非共價力，高選擇性的結(jié)合到α-glucosidase的活性中心，可逆與底物競爭活性位點，從而達到抑制的效果；除上述所列出的α-glucosidase抑制劑類型外，還有包括動物和微生物來源的抑制劑等。雖然現(xiàn)在很多合成藥物在臨床糖尿病的治療中起到了很好的治療效果，但是對人體的毒副作用也是不可小視的。例如，此類藥物服用一段時間后會出現(xiàn)腸鳴音亢進的反應(yīng)，還會出現(xiàn)腹痛、腹脹、排氣增多等胃腸功能的紊亂和皮膚反應(yīng)[17]。因此天然植物來源的抑制劑越來越來成為降血糖藥物開發(fā)的重點，然而植物成分的藥理藥效不明，會制約了降血糖藥物的開發(fā)，因此探討天然活性成分對α-glucosidase抑制機理的研究也是現(xiàn)在迫切需要的，本課題中的研究表明葛根素是一種可逆的競爭型α-glucosidase,誘導(dǎo)了酶活性的降低；與陽性對照阿卡波糖對比，葛根素能夠明顯的抑制大鼠血糖水平的增長，對調(diào)節(jié)血糖水平起到重要作用，為臨床降血糖提供了理論基礎(chǔ)。

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(編校：譚玲)

Study of the inhibitive mechanism of puerarin on α-glucosidase

XU Ting,CHU Jiang-hong,DING Ping-ying,NI Lian-songΔ

(Department of Endocrinology, Taizhou Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University, Lin hai 317000, China)

ObjectiveTo study the inhibitory mechanism of puerarin on α-glucosidase.Methods40 male mices were divided into 5 groups:control group,acarbose group, puerarin(2.5,5.0,10) μM group,8 mices in each group.Studied the inhibitory effect and inhibition kinetics of puerarin on α-glucosidase by enzyme inhibition kinetics method,and spectrophotometer was used to determine the effect of puerarin on blood glucose change in mices.ResultsPuerarin was a reversible competitive α-glucosidase inhibitor, the value half inhibition concentration (IC50) and inhibition constant (Ki) were obtained to be (4.32±0.42) μM and (0.41± 0.09) μM, respectively.Compared with acarbos,puerarin could inhibite the increase of the blood glucose levels. ConclusionPuerarin as a competitive α-glucosidase inhibitor, can reduce the enzyme actiuity, and play an important role in fall blood ylucose level.

puerarin; α-glucosidase; inhibitory effect; blood glucose levels; diabetes

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目(2011KYA160)

徐婷，女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：糖尿病慢性并發(fā)癥及治療研究，E-mail：xutingdoc@163.com；倪連松，通訊作者，男，碩士，研究生導(dǎo)師，研究方向：糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)病機制及治療研究，E-mail：412168451@qq.com。

R285

A

1005-1678(2015)01-0043-04