軟骨素酶ABC誘導(dǎo)大鼠尾椎間盤退變的實(shí)驗(yàn)研究

王炎,王琨,吳小濤

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 骨科，江蘇 南京 210009)

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軟骨素酶ABC誘導(dǎo)大鼠尾椎間盤退變的實(shí)驗(yàn)研究

王炎1,2,王琨1,2,吳小濤1,2

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 骨科，江蘇 南京 210009)

目的 探討軟骨素酶ABC(chondroitinase ABC，ChABC)誘導(dǎo)SD大鼠椎間盤退變動物模型的穩(wěn)定性及可行性。方法 80只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為7天組和30天組，每組40只，取濃度為0.25 unit/mL ChABC 0.1 mL，注入(coccygeal vertebrae，Co7/8)椎間盤作為造模組，(coccygeal vertebrae，Co6/7)近端椎間盤不作處理作為對照組。術(shù)后第7天、第30天行尾椎7.0T磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)，取標(biāo)本行HE染色，阿爾新藍(lán)染色，馬森三色染色及Ⅱ型膠原和蛋白多糖免疫組織化學(xué)，觀察椎間盤退變情況。結(jié)果 MRI結(jié)果顯示：術(shù)后第7天，第30天，對照組Co6/7椎間盤T2信號強(qiáng)度均未見明顯變化，而造模組Co7/8椎間盤T2信號強(qiáng)度均明顯降低，Co7/8與Co6/7椎間盤T2信號值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩時(shí)間點(diǎn)Co7/8椎間盤T2信號值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后第7天和第30天，HE染色，阿爾新藍(lán)染色，馬森三色染色提示Co7/8椎間盤均出現(xiàn)明顯退變，Co7/8椎間盤Ⅱ型膠原和蛋白多糖免疫組織化學(xué)積分光密度值均較Co6/7椎間盤顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 軟骨酶素ABC誘導(dǎo)構(gòu)建大鼠尾椎間盤退變模型是一種簡單有效、重復(fù)性好的建模方法。

椎間盤退變；軟骨素酶ABC；動物模型

隨著生活節(jié)奏和人類作息習(xí)慣等各種因素的改變，下腰痛的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，腰間盤退行性病變作為下腰痛的主要致病因素也已得到了醫(yī)學(xué)界的廣泛認(rèn)可[1]。腰間盤退行性病變的發(fā)病誘因較多，截至到目前仍未能完全明確其發(fā)病機(jī)制，這也為其臨床診治帶來了諸多障礙[2]。動物模型由于具有樣本獲取速度快、實(shí)驗(yàn)對象數(shù)量大等優(yōu)點(diǎn)，在各類疾病的發(fā)病機(jī)制及臨床診治的基礎(chǔ)研究中發(fā)揮著重要作用。鑒于腰間盤退行性病變發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，借助動物模型則可為腰間盤疾病的診治提供充足的臨床基礎(chǔ)資料，且可避免危及患者的生命健康。

目前建立椎間盤退變模型的方法包括：機(jī)械干預(yù)法、外傷、酶化學(xué)法、缺血、基因敲除、吸煙等[3]，本實(shí)驗(yàn)通過向SD大鼠尾椎間盤注入軟骨素酶ABC(chondroitionase ABC,ChABC)建立椎間盤退變的動物模型，通過7.0T磁共振及組織學(xué)染色及免疫組化觀察，探討建立腰間盤退行性病變動物模型的穩(wěn)定性及可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級SD大鼠80只，雄性，平均月齡2個(gè)月，平均體質(zhì)量(300±50)g，由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證編號：SCXK2014-0007；使用許可證編號：SYXK(蘇)2014-0035)，實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)條例》。隨機(jī)分為第7天、第30天造模組，共2組，每組各40只。分別按標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室室溫控制在25 ℃左右，食物和飲用水充足。

1.2 試劑與儀器 HE染色，阿爾新藍(lán)染色，馬森三色試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；免疫組織化學(xué)染色試劑盒(福州邁新生物科技有限公司)；大鼠Ⅱ型膠原和蛋白多糖抗體(ABCAM)。

Bruker 7.0T小動物磁共振成像儀、切片機(jī)(美國Reichert HistoSTAT)；顯微鏡(Olympus)、超凈工作臺(蘇州凈化)。

1.3 動物模型的建立 用3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射，麻醉成功后，將動物俯臥于手術(shù)臺上，四肢固定。尾部備皮，碘伏消毒手術(shù)區(qū)域。模型組尾部正中縱向切口，依次切開皮膚和筋膜，暴露椎間盤。選取尾椎第6～7(coccygeal vertebrae，Co6/7)，7～8(coccygeal vertebrae，Co7/8)椎間盤用于本次研究，將0.1 mL軟骨素酶ABC(0.25 unit/mL)注入到Co7/8椎間盤，Co6/7近端椎間盤不作處理作為對照。術(shù)后立即給予每只SD大鼠青霉素5萬U肌注。

1.4 影像學(xué)檢查 2組動物分別于術(shù)后第7天、30天麻醉后采用BRUKER公司7.0T磁共振掃描(magnetic resonance imaging，MRI)檢查。自旋回波(spin echo，SE)序列掃描參數(shù)：矢狀面T2—重復(fù)時(shí)間4000 ms，回波時(shí)間1 ms，視野10.60，層面厚度0.94 mm，層面數(shù)9，均值4 mm；T2 map—重復(fù)時(shí)間2500 ms，回波時(shí)間16 ms，視野8.00，層面厚度1 mm，層面數(shù)9，均值1 mm。掃描后通過隨機(jī)軟件采用最小二乘法獲得T2map圖像，并測量Co6/7、Co7/8椎間盤的T2信號值。

1.5 組織學(xué)染色 MRI檢查結(jié)束后處死所有大鼠，完整取出Co6/7，Co7/8椎間盤，4%的中性福爾馬林溶液室溫下固定24 h，pH=7.4，10%的EDTA脫鈣30 d。透明處理后石蠟包埋，椎間盤連續(xù)性切片，制備成厚度5 μm的切片，行蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosin, HE)染色，阿爾新藍(lán)(alcian blue)染色，馬森三色(Masson trichrome)染色。光鏡下觀察椎間盤形態(tài)的變化。

1.6 免疫組化檢測Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達(dá) 新鮮標(biāo)本用生理鹽水沖洗 2～3遍，行OCT冷凍包埋，冰凍切片機(jī)橫斷面連續(xù)切片，每個(gè)節(jié)段椎間盤做成5張切片，每張厚約5～6 μm，選擇結(jié)構(gòu)較為完整的2張切片進(jìn)行Envision染色，在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察組織細(xì)胞中Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達(dá)情況并拍照，使用美國Media Cybernetics公司專業(yè)圖片分析軟件Image-Pro Plus 6.0得出Ⅱ型膠原和蛋白多糖積分光密度值(integrated optical density，IOD)。

2 結(jié)果

2.1 影像學(xué)結(jié)果 對照組術(shù)后第7天，第30天Co6/7椎間盤T2信號強(qiáng)度均未見明顯變化，而造模組Co7/8椎間盤T2信號強(qiáng)度均明顯降低，T2值分別為(50.26±11.97)ms和(49.32±12.01)ms，Co7/8與Co6/7椎間盤T2信號值差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。造模組術(shù)后第7天與第30天的Co7/8椎間盤T2信號值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 術(shù)后第7天和第30天的SD大鼠尾椎間盤的磁共振結(jié)果Fig.1 MRI results of rats spinal disc at the seventh day and thirtieth day after operation

2.2 組織學(xué)染色結(jié)果 術(shù)后第7天和第30天，對照組Co6/7椎間盤HE染色展現(xiàn)清晰的椎間盤界限，椎間盤中央?yún)^(qū)髓核可見清晰的基質(zhì)，較多的脊索細(xì)胞和類軟骨細(xì)胞且排列均勻，細(xì)胞數(shù)目多，增殖活躍。類軟骨細(xì)胞較小，間質(zhì)不均勻并呈紅色，可存在于軟骨陷窩內(nèi)。而術(shù)后第7天、30天，造模組Co7/8椎間盤HE染色可見髓核的脊索細(xì)胞及軟骨樣細(xì)胞減少，纖維環(huán)與髓核之間的界限模糊，炎性細(xì)胞浸潤、軟骨細(xì)胞增生、粘液樣退變、細(xì)胞死亡、裂隙形成以及顆粒樣改變。術(shù)后第7天和第30天對照組中，Co6/7椎間盤的髓核中阿爾新藍(lán)強(qiáng)染色，而馬森三色弱染色，這提示髓核中存在大量的蛋白多糖，少量的膠原；在纖維環(huán)中相反，馬森三色強(qiáng)染色，能很清晰地顯示椎間盤板層結(jié)構(gòu)，而阿爾新藍(lán)弱染色。術(shù)后第7天和第30天，造模組Co7/8椎間盤大量藍(lán)染物質(zhì)紊亂，丟失，纖維細(xì)胞增生，維環(huán)板層結(jié)構(gòu)紊亂。見圖2。

圖2 組織學(xué)染色結(jié)果Fig.2 Results of histological staining

2.3 Ⅱ型膠原和蛋白多糖免疫組化結(jié)果 與對照組比較，造模組術(shù)后第7天和第30天Co6/7椎間盤Ⅱ型膠原和蛋白多糖免疫組化IOD均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而造模組術(shù)后第7天和第30天Co7/8椎間盤Ⅱ型膠原和蛋白多糖免疫組化IOD差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。所有染片背景染色清晰，Ⅱ型膠原和蛋白多糖陽性反應(yīng)呈棕褐色，主要位于胞漿內(nèi)。所有切片均廣泛表達(dá)Ⅱ型膠原和蛋白多糖，Co6/7椎間盤高表達(dá)，而Co7/8椎間盤相對低表達(dá)，見圖3。

表1 Ⅱ型膠原和蛋白多糖免疫組化IOD結(jié)果±s)

*P<0.05，與對照組相比，compared with control group

圖3 術(shù)后第7天和第30天Ⅱ型膠原和蛋白多糖免疫組化染色結(jié)果(×400)Fig.3 Immunohistochemistry staining results of collagen typeⅡ and proteoglycan atthe seventh day after operation and thirtieth day(×400)

3 討論

椎間盤病變作為下腰痛的主要病因，其病變程度成退行性加重，在當(dāng)前的醫(yī)療條件下很難有效阻止或逆轉(zhuǎn)已發(fā)生器質(zhì)性損傷的椎間盤病變。無論是外科手術(shù)或是牽引、按摩等治療方式，在一定程度上僅能緩解椎間盤病變的癥狀，欲完全解除癥狀或修復(fù)損傷較為困難。隨著醫(yī)療科技的不斷發(fā)展，近年來可以通過注射特殊生長因子、基因干預(yù)、細(xì)胞移植等手段及時(shí)干預(yù)退變的諸多環(huán)節(jié)[4]，因此有必要確立一種動物椎間盤退變的模型來評估新治療方法，而這種模型必須具備以下幾個(gè)特征[5]：①重復(fù)性好；②簡單易行；③能再現(xiàn)椎間盤退變的客觀規(guī)律；④選擇的動物在解剖生理上盡可能與人類相似。SD大鼠飼養(yǎng)方便、抵抗力強(qiáng)、價(jià)格低廉、椎間盤在解剖和生化結(jié)構(gòu)上與人類椎間盤比較相似，可用于大規(guī)模實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)向SD大鼠尾椎間盤內(nèi)注射軟骨酶素ABC來建立椎間盤退變的模型。

ChABC[6]是一種多糖酶，特異性降解某些糖胺聚糖側(cè)鏈，如硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質(zhì)酸等。髓核是由大量的糖胺聚糖高分子組成，向椎間盤內(nèi)注射ChABC可以使髓核中的糖胺聚糖分子減少，糖胺聚糖分子的減少是人類椎間盤退變的早期變化之一，本實(shí)驗(yàn)通過向SD大鼠尾椎間盤注射ChABC降低糖胺聚糖的含量，可以引起椎間盤變化，這一系列的變化模擬了人椎間盤退行性疾病的各個(gè)方面[7-8]，包括椎間盤磁共振T2信號降低；椎間盤組織結(jié)構(gòu)紊亂；髓核不斷地?cái)嗔?、濾泡結(jié)構(gòu)減少甚至消失；髓核細(xì)胞中蛋白聚糖和Ⅱ型膠原含量降低、纖維環(huán)板層結(jié)構(gòu)紊亂等。

MRI技術(shù)可以作為檢查椎間盤形態(tài)一種可靠的手段，評價(jià)椎間盤退變的程度通常是按含水量分級的，而含水量可以被T2信號強(qiáng)度反應(yīng)，Modic等[9]指出椎間盤T2信號的減弱與退變的程度相關(guān)。雖然T2加權(quán)像被用來評價(jià)椎間盤退變，但信號強(qiáng)度由于測定與放大因素不能得出具體值[10]，所以本實(shí)驗(yàn)使用T2map來測量椎間盤水容量的T2值。本研究發(fā)現(xiàn)在造模第7天，造模椎間盤Co7/8磁共振T2信號顯著降低，T2值較對照組有顯著差異(P<0.05)。造模第30天與造模第7天相比，Co7/8磁共振T2信號差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這為今后的研究提供了參考，向椎間盤注射ChABC制造椎間盤退變模型，在造模第7天就有顯著效果，相比其他造模方法時(shí)間更短，達(dá)到的實(shí)驗(yàn)效果一樣。

HE染色、阿爾新藍(lán)染色、馬森三色染色可以從組織學(xué)的層面評價(jià)椎間盤退變的效果。阿爾新藍(lán)染色主要對蛋白聚糖敏感，馬森三色對膠原敏感[11-12]，可以用阿爾新藍(lán)染色反映髓核結(jié)構(gòu)的變化，馬森三色反映纖維環(huán)結(jié)構(gòu)的變化。在造模第7天、30天，本研究觀察到Co7/8椎間盤內(nèi)髓核軟骨細(xì)胞減少，纖維細(xì)胞增生，組織壞死，玻璃樣變及纖維化，髓核毛細(xì)血管的侵入，炎性細(xì)胞的浸潤等；維環(huán)板層結(jié)構(gòu)紊亂，軟骨細(xì)胞巢狀增生，纖維環(huán)粘液樣退變，纖維環(huán)裂隙形成；軟骨終板細(xì)胞減少，膠原纖維環(huán)聚集成片。與椎間盤退變相關(guān)的生物化學(xué)變化是細(xì)胞外基質(zhì)的降解，細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分是膠原和蛋白多糖，椎間盤以Ⅱ型膠原為主，尤其是在髓核中。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在造模后第7天和第30天，Ⅱ型膠原和蛋白多糖的含量顯著減少，驗(yàn)證了良好的造模效果。

本研究設(shè)計(jì)復(fù)制椎間盤退變的模型有很多優(yōu)點(diǎn)：首先，操作簡單，尾椎間盤容易定位，造模的過程中大鼠死亡率、術(shù)后感染率低，研究人員可以在很短的時(shí)間內(nèi)就熟練掌握該造模技術(shù)；其次，費(fèi)用低，高效率，在造模的第7天就能產(chǎn)生很好椎間盤退變效果。但所有動物模型都有局限性，本實(shí)驗(yàn)中雖然退變的其他特征是可控制的并且不矛盾，但是機(jī)械效應(yīng)是直接的，不能代表人類椎間盤退行性疾病的自然緩慢進(jìn)程。同時(shí)，與人類的椎間盤不同的是，大鼠自始至終都有脊索細(xì)胞，尾椎間盤與腰椎間盤有不同的生理機(jī)械負(fù)荷。因此，更加理想、經(jīng)濟(jì)的動物模型的開發(fā)需要在未來工作中進(jìn)一步探索研究。

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(編校：王冬梅)

Experiment study of rats model of coccygeal disc degeneration induced by chondroitinase ABC

WANG Yan1,2,WANG Kun1,2,WU Xiao-tao1,2

(1.Medical College of Southeast University, Nanjing 210009, China; 2.Department of Orthopaedics, Zhongda Hospital Affiliated to Southeast University, Nanjing 210009, China)

ObjectiveTo investigate the chondroitinase ABC (ChABC)stability and feasibility of intervertebral disc degeneration induced by SD in rat animal model.Methods80 male SD rats were selected and randomly divided into two groups, 40 in each group,which were the 7 days and 30 days after-lesion groups.Co7/8 disc were injected with ChABC (0.2 mL,0.25 unit/mL)as model group while Co6/7 were set as blank control.7.0 Tesla small animal MRI was performed after 7 days and 30 days after the operation.Subsequently,Co6/7 and Co7/8 in each rat were taken and underwent HE staining,Alcian blue staining and trichrom Masson staining.Additionally,immunohistochemical staining of type II collagen and proteoglycan were also performed.ResultsMRI results showed that at both 7 and 30 days after the injection of ChABC:Co6/7 disc T2 signal intensity had no obvious change in control group,Co7/8 had developed significant degeneration in model group,T2 signals in Co7/8 and Co6/7,the difference had statistical significance (P<0.05).However,T2 signals in Co7/8 groups between two times did not have statistical significance; HE staining,Alcian blue staining and Masson staining in the Co7/8 were all decreased significantly compared to Co6/7 in each group.IOD values of immunohistochemical staining of type II collagen and proteoglycan in Co7/8 were lower than Co6/7(P<0.05). ConclusionIt indicates that a rat model of coccygeal disc degeneration induced by ChABC is easy,effective and reproducible.

intervertebral disc degeneration; ChABC;animal model

王炎，男，碩士在讀，研究方向：脊柱疾病的臨床診治，E-mail：61607653@qq.com；吳小濤，通訊作者，男，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，研究方向：脊柱及其他骨科疾病的診治，E-mail：wuxiaotao@medmail.com.cn。

R681.5+3

A

1005-1678(2015)01-0014-04