蘇龍嘎-4 湯對腹瀉幼鼠小腸絨毛上皮細胞移動和杯狀細胞的影響△

齊旺梅 烏 蘭 蔡 碩 關寶柱 金 鳳 畢力格 白玉華*

(1.內蒙古農業(yè)大學，內蒙古 呼和浩特 010018; 2.內蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內蒙古 呼和浩特 010065)

腹瀉對人和動物引起腸道正常菌群失調，吸收障礙，營養(yǎng)狀態(tài)和免疫功能降低。小兒反復腹瀉易演變?yōu)闋I養(yǎng)不良、佝僂病、貧血、慢驚風等多種慢性疾?。?，2，5］。小兒腹瀉蒙醫(yī)分為寒熱兩型病。熱瀉是由于熱、銳性外因致小兒三根失調，齊蘇和希拉之熱偏盛下注腸腑而引起。臨床上對小兒腹瀉采取辨證分型的基礎上進行治療［3］。

蒙藥蘇龍嘎-4 湯為止瀉作用顯著的傳統(tǒng)湯劑，由連翹、拳參、木通、麥冬組成。引自《內蒙古蒙成藥標準》和《蒙醫(yī)傳統(tǒng)驗方》，主治大小腸熱、腸刺痛、熱瀉的傳統(tǒng)方劑［4］。臨床實驗證明蘇龍嘎-4 湯以清熱，抑希拉，木通清腑之熱，拳參解毒和止瀉，對大小腸熱癥有特效［5］。還有對傷寒、綠膿桿菌及金黃色葡萄球菌有較強的抑菌作用［6］。

目前臨床上常用蘇龍嘎-4 湯治療嬰幼兒腹瀉?。?，6］，治療豬腸熱痢疾及傳染性胃腸炎和藏獒犬細小病毒感染等［7，8］。動物實驗證明，蘇龍嘎- 4 湯對腸道菌群有影響［9］。腹瀉與小腸黏膜上皮細胞的移動及杯狀細胞有相關性，蘇龍嘎-4 湯的止瀉作用可能與小腸黏膜上皮細胞的移動及杯狀細胞有關。本文采用番瀉葉誘導幼鼠腹瀉模型［10］，用細胞標識劑BrdU 標識合成期細胞移動位置，用PAS 染色觀察杯狀細胞數(shù)量觀察蘇龍嘎-4 湯的干預作用。

1 材料

3 ～4wk 齡wistar 幼鼠25 只，體重64 ±11g(內蒙古大學實驗動物繁殖中心購入)，在內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院動物實驗室內飼養(yǎng)，自由飲水，保持溫度20 ±2℃，濕度50～55%，光照早8：00 到晚11：00。蘇龍嘎-4、番瀉葉購于內蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院。

2 方法

2.1 腹瀉模型建立：分為空白組、腹瀉模型對照組、蘇龍嘎-4 湯低、中和高劑量組，每組各5 只。取0.6g/mL 濃度的番瀉葉，連續(xù)3d 灌胃2.5mL/Kg。造模d4，灌胃番瀉葉煎劑2h 后分別灌胃蘇龍嘎-4 湯0.04g/mL(低劑量)，0.06g/mL(中劑量)和0.08g/mL(高劑量)蘇龍嘎-4 湯溶液各2.5mL/Kg(體重)，治療4d;模型組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)2.5mL/kg(體重)。

2.2 取材與切片：對所有幼鼠腹腔內注射細胞標識劑BrdU 溶液5mL/kg(體重)，18h 后在麻醉狀態(tài)下解剖小鼠，取出十二指腸，空腸和回腸的中段部位。用4%多聚甲醛固定24h 以上。

將組織修塊為0.5 ～1cm，用5%至20%梯度蔗糖浸泡，液氮中速凍，用冰凍切片機切成4μm。

2.3 免疫組化：將冰凍切片用PBS 緩沖液(含0.05%Tween-20 的pH7.4 的磷酸鹽緩沖液)浸泡10min，3 次。為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性染色，在甲醇和0.5%過氧化氫浸泡各30min。蒸餾水洗凈后，0.5 鹽酸溶液處理15min，PBS 洗凈后用50 倍稀釋的犢牛正常血清封閉，室溫下反應1h，用100 倍稀釋的抗BrdU 小鼠IgG(一次血清)，在4℃反應18 ～24h。用PBS 清洗后，加50 倍稀釋的小鼠IgG 抗大鼠(二次血清)，反應1h 后用PBS 清洗，用50 倍稀釋的小鼠PAP，反應1h，PBS 清洗后，加0.5%DAB 顯色液，顯微鏡下觀察細胞核染成棕色或黑褐色(如細胞核以外被染色視為非特異性染色)為終止反應，蒸餾水洗凈，蘇木精對比染色后進行脫水，透明，封片。

2.4 PAS 染色法：將冰凍切片蒸餾水洗，過碘酸酒精液10min，自來水沖洗，Schiff 氏酒精液避光處理10min，亞硫酸水涮洗15min，流水沖洗。用邁耶蘇木精染核1s，流水沖洗，脫水、透明、封固。細胞質內紫紅色，細胞核藍色為PAS 陽性。

2.5 組織學定量法：稀便等級：根據(jù)稀便在濾紙上形成污跡面積的直徑分為一級(1cm 以下)、二級(1 ～1.9cm)、三級(2 ～3cm)和四級(大于3cm)。

2.6 腸絨毛，腸隱窩和BrdU 陽性上皮細胞的位置：從腸隱窩最底部上皮細胞到腸隱窩開口部上皮細胞的距離為腸隱窩長度;從腸隱窩開口部上皮細胞到腸絨毛最頂部上皮細胞的距離為腸絨毛長度。從腸隱窩最底部上皮細胞到腸絨毛BrdU 陽性上皮細胞的最領先細胞的距離為BrdU 陽性上皮細胞的移動位置。各組5 個幼鼠的小腸各部位組織中任選20 個腸隱窩和腸絨毛測量。

2.7 杯狀細胞數(shù)量：由于個體差異腸絨毛長短不同，腸絨毛上皮細胞的數(shù)量也有所不同。為了比較各部位同一個位置中存在的杯狀細胞數(shù)量，本實驗統(tǒng)計了從腸絨毛根部往上200um 距離之內存在的杯狀細胞數(shù)量。

3 結果

3.1 對腹瀉模型幼鼠：用番瀉葉灌胃建立腹瀉模型幼鼠效果顯著。番瀉葉灌胃1h 后出現(xiàn)稀便，3 ～5h 稀便程度最高，6h 候后稀便數(shù)量逐漸減少(圖1)。

3.2 小腸黏膜組織學定量結果：在光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，幼鼠小腸黏膜沒有明顯的皺褶，有指狀腸絨毛和管狀的腸隱窩。幼鼠小腸腸絨毛從十二指腸到回腸逐漸變短。腸隱窩各部位間沒有顯著差異。但在十二指腸和空腸，腹瀉組的腸絨毛比空白組短，治療組的腸絨毛比腹瀉組長(圖2，3);腸隱窩在腹瀉組比空白組變長，在治療組比腹瀉組長(圖4，5)。在回腸、腸絨毛和腸隱窩長度在腹瀉組和治療組與空白組沒有顯著差異(圖6，7)。

圖3

圖5

圖7

3.3 BrdU 陽性腸絨毛上皮細胞的移動：BrdU 腹腔注射后在腸隱窩增殖細胞的合成期細胞核內進入細胞標識劑BrdU。用單克隆抗體檢出BrdU 陽性上皮細胞，測量其最領先細胞的位置為該上皮細胞的18h 候內腸絨毛上移動的距離。與空白組比較，腹瀉和治療組BrdU 陽性上皮細胞的位置在十二指腸和空腸逐漸增加，尤其在高劑量組顯著增加(圖8，9)。在回腸沒有顯著差異(圖10)。

圖8

圖9

圖10

3.4 杯狀細胞的數(shù)量：與空白組比較杯狀細胞的數(shù)量在腹瀉組減少，在治療組比腹瀉組增加，整體看在高劑量組增加的數(shù)量比低中劑量明顯多(圖11，12，13)。

圖11

圖12

圖13

4 討論

番瀉葉誘導幼鼠腹瀉是常用方法，番瀉葉為刺激性瀉藥，通過腸黏膜和神經(jīng)從刺激腸蠕動，番瀉甙在小腸部分被吸收，后經(jīng)血流或膽汁進入大腸，而主要則由小腸直接進入大腸，在腸內細菌作用下經(jīng)水解、還原等變化成為大黃酸蒽酮或大黃酸蒽酮-8 -葡萄糖甙。番瀉甙可阻止葡萄糖和Na 的跨腸壁轉運吸收。本次研究表明，幼鼠腹瀉后十二指腸和空腸腸絨毛明顯變短，表明番瀉葉在小腸的近段影響較大，加快腸黏膜上皮細胞脫落，導致腸絨毛變短。但在回腸影響不明顯是也許在小腸近段被消化吸收的較快，對回腸的刺激較小。腸隱窩在腹瀉組有所增加是為了補充脫落的上皮細胞，機體調節(jié)腸隱窩上皮細胞的增殖和分化。蘇龍嘎-4 湯治療后腸絨毛和腸隱窩均變大的結果表明，蘇龍嘎-4 湯對腹瀉幼鼠的腸上皮細胞生長發(fā)育具有調節(jié)和促進作用。

杯狀細胞數(shù)量結果表明，腹瀉引起腸黏膜屏障被破壞，內環(huán)境失調，黏液細胞分泌被抑制，數(shù)量減少。但蘇龍嘎-4 湯治療后，杯狀細胞明顯增加，揭示了蘇龍嘎-4 湯對杯狀細胞的分化和生長具有一定的調節(jié)和促進作用。蘇龍嘎-4 湯促進分泌黏液的杯狀細胞的分泌功能，改善腸道內環(huán)境，修復黏膜屏障的完整性，從而起到止瀉作用。

蘇龍嘎-4 湯中、高劑量組作用效果顯著，具有明顯的量效關系，如臨床效果弱時可根據(jù)實際情況提高給藥劑量，以保證療效。

［1］張琳，腹瀉患兒腸道菌群微生態(tài)學研究進展［J］.河北醫(yī)藥，1994，16(6)：354 -355.

［2］格林其木格.蒙醫(yī)兒科學［M］.赤峰：內蒙古科學技術出版社，1988：222.

［3］吉格木德.蒙醫(yī)基礎理論［M］.呼和浩特：內蒙古人民出版社，1984.

［4］內蒙古自治區(qū)衛(wèi)生廳編.內蒙古蒙成藥標準［M］.赤峰：內蒙古科學技術出版社，1984：12.

［5］紅梅.蒙醫(yī)治療70 例嬰幼兒腹瀉臨床觀察［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2000，(3)：18.

［6］鋼巴特爾，圖雅.蘇龍嘎-4 湯、掃日勞-4 湯、永瓦-4湯抑菌作用的對比研究［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2005，(1)：21 -22.

［7］謝寶昌，等.蘇龍嘎-4 湯治療豬腸熱痢疾［J］.中獸醫(yī)雜志，1992，69(4)，10.

［8］李光輝，等.蒙藥蘇龍嘎-4 湯加減治療藏獒犬細小病毒感染初探［J］.內蒙古民族大學學報(自然科學版)，2008，23(8)，176 -178.

［9］齊旺梅，等.蘇龍嘎-4 湯對腹瀉幼鼠腸道乳酸桿菌、大腸桿菌和總需厭氧菌的影響［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2014，4(20)，47 -49.

［10］郎秀壯，丁旺.番瀉葉的研究概況［J］.實用醫(yī)技雜志，2005 12(5)，1294.