額爾敦-烏日勒及其優(yōu)化方對(duì)家兔動(dòng)脈硬化易損斑塊中MMPs 的活性調(diào)節(jié)作用△

都格爾 麻春杰 烏蘭其其格 蓮 花

(1.內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065; 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)易損斑塊(Vulnerable Plaque，VP)是指不穩(wěn)定和有血栓形成傾向的斑塊，具有破裂傾向、易于發(fā)生血栓形成和(或)進(jìn)展迅速的危險(xiǎn)斑塊［1］。大量研究表明，約70% 至80% 的AS 血栓形成(Atherothrombosis)是由于輕、中度狹窄的動(dòng)脈斑塊的破裂、繼發(fā)血栓形成所致，動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成疾病以高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率、并發(fā)癥多等成為全球性的重負(fù)和世紀(jì)的挑戰(zhàn)。根據(jù)有關(guān)報(bào)告，由動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成導(dǎo)致的死亡占人群總死亡的28.7% ～52%［2］，因此，穩(wěn)定易損斑塊是防治動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成性疾病的關(guān)鍵，亦是目前醫(yī)學(xué)界防治心腦血管急性事件發(fā)生的重要目標(biāo)。大量研究證明，血清基質(zhì)金屬蛋白酶(matri metalloproteinase，MMPs)是造成斑塊不穩(wěn)定的重要原因之一。MMPs 是一組可消化細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的重要酶類，它通過降解纖維帽成分，破壞其結(jié)構(gòu)加速斑塊破裂導(dǎo)致ACS 發(fā)生［3］。蒙藥額爾敦-烏日勒(珍寶丸)以其確切的療效和安全、低毒等優(yōu)勢(shì)和鮮明的蒙醫(yī)藥特色、獨(dú)特的主治功效，在臨床中起到重要作用。在防治心腦血管疾病方面有潛在價(jià)值，已引起學(xué)者們的關(guān)注。近些年對(duì)額爾敦-烏日勒的研究逐步深入，臨床研究表明其治療心腦血管疾病療效顯著［4，5］。前期研究表明，額爾敦-烏日勒具有顯著的調(diào)節(jié)血脂，改善血液流變學(xué)可能是其抗AS 作用機(jī)制之一，還能夠有效干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展［6］，具有消退早期動(dòng)脈粥樣硬化的作用，可能通過降脂、抗炎等途徑發(fā)揮作用［7］。在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，額爾敦-烏日勒與陽(yáng)性對(duì)照藥阿司匹林［8］和辛伐他?。?］有相似的作用，甚至有的作用優(yōu)于辛伐他汀。因此我們，通過觀察額爾敦-烏日勒及其優(yōu)化方對(duì)家兔AS-PV 對(duì)MMPs 活性與表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，探討額爾敦-烏日勒及其優(yōu)化方抗AS-PV 的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物與試劑 額爾敦-烏日勒［9］：內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司;國(guó)家準(zhǔn)字：Z15020410;規(guī)格：2g/10 粒，30 粒/瓶;生產(chǎn)日期：2012-07-12;產(chǎn)品批號(hào)：120706;有效期：至2015-06。額爾敦-烏日勒優(yōu)化方：與額爾敦-烏日勒同樣標(biāo)準(zhǔn)。辛伐他汀片：山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司;國(guó)家準(zhǔn)字：H20083840;生產(chǎn)日期：20121007;規(guī)格：20mg/片，12 片/1 板，板/盒;有效期：20141006。青霉素鈉注射液：華北制藥股份有限公司;國(guó)家準(zhǔn)字：H13020655;生產(chǎn)日期：20120716;規(guī)格：160 萬單位/瓶×50 瓶/盒;有效期：201406。肝素鈉注射液，d 津生物化學(xué)制藥有限責(zé)任公司;執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：國(guó)家準(zhǔn)字：H12020505 生產(chǎn)日期：20121007;規(guī)格：1.25 萬單位/2ml，2ml /支，2ml ×10 支/盒;有效期：20141006。3%戊巴比妥納注射液，胎牛血清白蛋白(Albumin Bovine fraction V)：上海生物工程有限公司，雞蛋黃、豬油、膽固醇：北京愛普華美生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20120715;血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限公司。Trizol 試劑來源invitrogen，貨號(hào)15596-026;DEPC 處理水試劑來源上?；鶢栴D生物，貨號(hào)BYL40387;氯仿HPLC 級(jí)試劑、異丙醇HPLC 級(jí)試劑、無水乙醇AR 級(jí)試劑來源均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán);SYBRGreen PCR 試劑盒來源Thermo，貨號(hào)F-415XL;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒來源Thermo，貨號(hào)#K1622。

1.2 動(dòng)物 健康新西蘭白兔，雄性，體重(2.0 ±0.2)kg，90只。由北京市海淀區(qū)興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠提供(許可證編號(hào)：SCXK(京)2012-0005，防疫合格證號(hào)20120038)，試驗(yàn)在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成。實(shí)驗(yàn)條件：(18 ±2)℃，相對(duì)濕度(40 ± 15)%。

1.3 主要儀器 日立7180 型全自動(dòng)生化分析儀：制造商—日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)(日本國(guó)東京港區(qū)西新橋—丁目24 盤14 號(hào));球囊擴(kuò)張導(dǎo)管(人用)：導(dǎo)引導(dǎo)管規(guī)格：145cm×0.84mm，導(dǎo)引導(dǎo)絲規(guī)格：145 ×0.36mm，球囊規(guī)格：20 ×2.5，テルモ株式會(huì)社(日本)，REF/コ—ド番號(hào)：DC-RH2520EHW，LOT/制造番號(hào)：120209，有效期：2015-01］;壓力泵：規(guī)格：20ml 美國(guó)麥瑞，PL303 電子d 平，國(guó)內(nèi)dna 擴(kuò)增儀：1109 型北京新技術(shù)所機(jī)械臂變溫水浴電子調(diào)溫40 ×0.5ml，國(guó)外dna 擴(kuò)增儀：dna thermal cycler perkin –elmercetus(美)變溫鋁塊壓縮機(jī)致冷48 × 0. 5mlus $20000.-。試劑儲(chǔ)存、標(biāo)本制備和基因擴(kuò)增與產(chǎn)物分析一起用品：2-8℃和-15℃冰箱，混勻器，微量加樣器(覆蓋1-1000μl)，移動(dòng)紫外燈(近工作臺(tái)面)，高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，超聲波水浴箱或加熱模塊，全自動(dòng)定量核酸擴(kuò)增儀(含計(jì)算機(jī)、打印機(jī))。消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾心)。TDL-5-A離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器制造廠;旋渦振蕩器：上海青浦瀘西儀器廠XW-80A;手握式電動(dòng)勻漿機(jī)：德國(guó)FLUKO(F6-10);低溫冷凍離心機(jī)：Sigma(3K15);移液器：吉爾森P 型移液器(Pipetman);Real- time 檢測(cè)儀：ABI (ABI-7300)。酶標(biāo)儀：芬蘭(Labsystems Multiskan MS)，儀器型號(hào)：352 型;洗板機(jī)：芬蘭(Thermo Labsystems)，儀器型號(hào)：AC8;離心機(jī)：微量高速離心機(jī)(國(guó)產(chǎn))，儀器型號(hào)：TG16W;培養(yǎng)箱：隔水式恒溫培養(yǎng)箱(國(guó)產(chǎn))，儀器型號(hào)：GNP-9080型。

2 方法

2.1 家兔分組喂養(yǎng) 取90 只家兔，所有均單籠喂養(yǎng)，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1wk 后，按抽簽法隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10 只)與造模組(80 只)。正常對(duì)照組喂普通飼料，每只予150g·d-1，造模組喂高脂飼料(1.0%膽固醇、5.0%豬油、5.0%蛋黃粉、89%基礎(chǔ)飼料)，每只予150g(普通飼料50g、高脂飼料100g)·d-1，自由攝食，正常對(duì)照組與造模組分別灌胃蒸餾水，飲水不限，取材截止。

2.2 造模分組給藥：造模組則采用下述方法建模。病變接近于人體不穩(wěn)定斑塊病變的發(fā)生發(fā)展過程的相對(duì)操作簡(jiǎn)單、造模成功率高、成本低、重復(fù)性好的建模方法［10］，將造模組選取采用復(fù)合因素(采用高脂飲食加免疫損傷和球囊拉傷方法)建模［11］，成功建立符合VP 病理形態(tài)學(xué)特征的動(dòng)物模型。從實(shí)驗(yàn)第1wk 開始按造模組家兔喂養(yǎng)法給予高脂飼料，取材截止。第2wk 時(shí)(高脂飼料1wk 后)予造模組家兔經(jīng)耳緣靜脈一次性注射牛血清白蛋白250 mg/mL/kg。第4wk 行經(jīng)股動(dòng)脈球囊拉傷術(shù)，術(shù)前12 h 禁食不禁水，以3%戊巴比妥鈉30 mg/kg 經(jīng)耳緣靜脈麻醉后將動(dòng)物固定于手術(shù)臺(tái)。左側(cè)腹股溝wk 邊區(qū)域剪毛常規(guī)皮膚消毒，沿股動(dòng)脈走行切開皮膚，分離皮膚和皮下組織，分離股動(dòng)脈約2 cm。結(jié)扎動(dòng)脈遠(yuǎn)端，用手術(shù)絲線提起動(dòng)脈近心端阻斷近端血流。在動(dòng)脈壁上約呈450“v”形剪開一小口，逆行插入肝素生理鹽水(1：15 稀釋)沖洗過的球囊導(dǎo)管(內(nèi)置鋼絲引導(dǎo))至胸主動(dòng)脈處。送入約20cm，抽出導(dǎo)絲，連接于50 mL 注射器，注入約20-30 mL 空氣，使球囊內(nèi)壓力達(dá)到約2 個(gè)大氣壓。維持此狀態(tài)緩慢拉出導(dǎo)管至其10cm 刻度處，然后回抽注射器解除球囊內(nèi)壓力，即有較強(qiáng)的阻力感繼而突然的落空感即可。重新插入導(dǎo)管，再牽拉1 次，以確保內(nèi)膜拉傷，反復(fù)2 次后撤出導(dǎo)管，結(jié)扎近心端。逐層縫合皮下組織和皮膚，青霉素鈉注射液沖洗創(chuàng)面。約8wk(確定模型成功后)將造模組隨機(jī)分為模型組(20 只)，額爾敦-烏日勒組(20 只)和額爾敦-烏日勒優(yōu)化方組(以下稱為：優(yōu)化方組)(13 只)，辛伐他汀組(15 只)。分別給予相應(yīng)藥物干預(yù)，給予額爾敦-烏日勒及其優(yōu)化方組家兔各0.4g/kg/d;給予辛伐他汀組家兔各5mg/kg/d。繼續(xù)予以高脂飲食，24wk 取材截止。

2.3 收集標(biāo)本：取材前12h 禁食，用3%的戊巴比妥鈉30 mg/kg 經(jīng)兔耳緣靜脈麻醉后，固定于手術(shù)臺(tái)上，用50 mL 注射器體外心臟采血，3000 r/min 離心10 min 后提取血清，血清貯存于-80°C 冰箱中備用;備用;經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞處死家兔，取其主動(dòng)脈、心臟、肝臟和腎臟等器官臟器，常規(guī)處理，為它項(xiàng)檢測(cè)備用。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用ANOVA 方差分析并行方差齊性檢驗(yàn)，兩組均數(shù)間比較采用t 檢驗(yàn)，結(jié)果以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以P＜0.05 為有顯著性差異。

3 結(jié) 果

3.1 一般狀況：每d 喂養(yǎng)、灌藥觀察當(dāng)中，家兔除了用于預(yù)實(shí)驗(yàn)和死亡以外，其余正常對(duì)照組家兔：精神狀態(tài)良好，行為活動(dòng)、反應(yīng)靈敏，毛色較白有光澤，目睛光亮有神，飼喂時(shí)不斷抓撓食盒，攝食、飲水、糞便未見明顯異常。模型組家兔：從5wk 左右開始發(fā)現(xiàn)精神欠佳，目光呆滯，活動(dòng)少，飲食可;8wk 左右飼喂時(shí)較少有反應(yīng)，喜臥少動(dòng)，飲食有所減少，毛色變暗;10wk 左右發(fā)現(xiàn)目睛混濁，可見有脂肪沉積，飲食略有增加;至12wk 時(shí)精神差，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍、多寐、飲食尚可、余同前。30d 稱體重一次，模型組與正常對(duì)照組體重隨時(shí)間變化呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但同一時(shí)間點(diǎn)兩組間體重比較差別不大，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)?？梢宰C實(shí)此造模因素基本未影響模型兔的正常生長(zhǎng)，見表1。

表1 正常組與模型組家兔體重比較(±s，㎏)

表1 正常組與模型組家兔體重比較(±s，㎏)

注：模型組與正常對(duì)照組比較，P ＞0.05

組類 樣本數(shù) 第一個(gè)月 第二個(gè)月 第三個(gè)月 第四個(gè)月正常組9 2.5 ±0.20 2.83 ±0.17 3.22 ±0.16 3.61 ±0.31模型組19 2.5 ±0.14 2.91 ±0.18 3.36 ±0.19 3.97 ±0.16

3.2 血清MMPs 活性檢測(cè)結(jié)果 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay 簡(jiǎn)稱ELISA)法檢測(cè)出各組家兔血清MMP-1、MMP-2、MMP-9 的活性，見表2。

表2 各組家兔基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP1、MMP2、MMP9)活性的比較(μg/L，± s)

表2 各組家兔基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP1、MMP2、MMP9)活性的比較(μg/L，± s)

注：模型組與正常組比較，* P ＜0.05;各給藥組與模型組比較，△P ＜0.05;與辛伐他汀組比較﹟P ＜0.05。

組別MMP1 MMP2 MMP9正常組n 12.320 ±0.1508 21.855 ±2.349 61.900 ±7.673模型組 8 19.291 ±0.2459* 27.505 ±0.438* 65.564 ±0.676*辛伐他汀組 8 13.939 ±0.1961△ 23.488 ±0.435△ 59.485 ±0.930△額爾敦-烏日勒組 10 9.873 ±0.1269△﹟ 20.356 ±0.399△﹟ 54.072 ±0.535△額爾敦-烏日勒優(yōu)化方組8 17.184 ±0.4459 25.645 ±0.338 63.463 ±1.235 8

圖1 各組血清MMP-1 的活性指標(biāo)比較圖

各組家兔血清MMP-1 的活性指標(biāo)比較：與正常組比較，模型組MMP-1 明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，額爾敦-烏日勒組和辛伐他汀組明顯降低(P＜0.05)，其中額爾敦-烏日勒組與辛伐他汀組間有顯著性差異(P＜0.05);與模型組相比，額爾敦-烏日勒優(yōu)化方組無顯著性差異。見圖(1)和表2。

圖2 各組家兔血清MMP-2 的活性指標(biāo)比較圖

各組家兔血清MMP-2 的活性指標(biāo)比較：與正常組比較，模型組MMP-1 明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，額爾敦-烏日勒組和辛伐他汀組明顯降低(P＜0.05)，其中額爾敦-烏日勒組與辛伐他汀組間有顯著性差異(P＜0.05);與模型組相比，額爾敦-烏日勒優(yōu)化方組無顯著性差異，見圖(2)和表2。

圖3 各組家兔血清MMP-9 的活性指標(biāo)比較圖

各組家兔血清MMP-9 的活性指標(biāo)比較：與正常組比較，模型組MMP-1 明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，額爾敦-烏日勒組和辛伐他汀組明顯降低(P＜0.05)，其中額爾敦-烏日勒組與辛伐他汀組間有顯著性差異(P＜0.05);與模型組相比，額爾敦-烏日勒優(yōu)化方組無顯著性差異，見圖(3)和表2。

3.3 檢測(cè)主動(dòng)脈MMPs 基因表達(dá)結(jié)果：從各組隨機(jī)取出家兔主動(dòng)脈組織樣本，采用實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative PCR)技術(shù)檢測(cè)出MMP-1、MMP-2、MMP-9 的基因表達(dá)水平。各組家兔基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP1、MMP2、MMP9)基因表達(dá)結(jié)果的比較如下：

表3 各組家兔基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP1、MMP2、MMP9)基因表達(dá)的比較(± s)

表3 各組家兔基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP1、MMP2、MMP9)基因表達(dá)的比較(± s)

注：模型組與正常組比較，* P ＜0.05;各給藥組與模型組比較，△P ＜0.05;

分組MMP1 MMP2 MMP9正常組0.0202 ±0.0045 0.0238 ±0.0048 0.0057 ±0.0014模型組 0.0495 ±0.0063* 0.0519 ±0.0018* 0.0117 ±00.0022*辛伐他汀組 0.0290 ±0.0088△0.0243 ±0.0032△0.0073 ±0.0012△額爾敦-烏日勒組0.0285 ±0.0082△0.0232 ±0.0070△0.0069 ±0.0006△

圖4 各組家兔主動(dòng)脈MMP-1 基因表達(dá)水平比較圖

各組家兔主動(dòng)脈MMP-1 的基因表達(dá)水平比較：與正常組比較，模型組MMP-1 明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，額爾敦-烏日勒組和辛伐他汀組明顯降低(P＜0.05)，額爾敦-烏日勒組與辛伐他汀組間無顯著性差異(P＞0.05)。見圖(4)與表3。

圖5 各組家兔主動(dòng)脈MMP-2 的基因表達(dá)水平比較圖

各組家兔主動(dòng)脈MMP-2 的基因表達(dá)水平比較：與正常組比較，模型組MMP-2 明顯升高P＜0.05;與模型組相比，額爾敦-烏日勒組和辛伐他汀組明顯降低(P＜0.05)，其中額爾敦-烏日勒組與辛伐他汀組間無顯著性差異(P＞0.05)。見圖(5)與表3。

圖6 各組家兔主動(dòng)脈MMP-9 的基因表達(dá)水平比較圖

各組家兔主動(dòng)脈MMP-9 的基因表達(dá)水平比較，與正常組比較，模型組MMP-9 明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，額爾敦- 烏日勒組和辛伐他汀組明顯降低(P＜0.05)，其中額爾敦-烏日勒組與辛伐他汀組間有顯著性差異(P＞0.05)，見圖(6)與表3。

4 小結(jié)

在成功建立造?；A(chǔ)上，分別給予相應(yīng)藥物干預(yù)，以辛伐他汀作對(duì)照，觀察額爾敦-烏日勒及其優(yōu)化方對(duì)實(shí)驗(yàn)性家兔AS-VP 的MMPs 的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，額爾敦-烏日勒能顯著降低血清MMP-1、MMP-2 和MMP-9的活性，減少主動(dòng)脈MMP-1、MMP-2 和MMP-9 的基因表達(dá)，表明額爾敦-烏日勒及其優(yōu)化方對(duì)MMPs(MMP-1、MMP-2 和MMP-9)具有顯著的調(diào)節(jié)作用，從本實(shí)驗(yàn)看，額爾敦-烏日勒及其優(yōu)化方調(diào)節(jié)MMPs(MMP-1、MMP-2和MMP-9)活性作用可能優(yōu)于辛伐他汀。因此，通過本實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為額爾敦- 烏日勒及其優(yōu)化方可能通過降低MMPs(MMP-1、MMP-2 和MMP-9)活性和基因表達(dá)而起到穩(wěn)定AS-VP 的作用。

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