固相萃取—高效液相色譜法測(cè)定焦糖色素中副產(chǎn)物2—甲基咪唑、4—甲基咪唑和2—乙?；?—（1，2，3，4—四羥基丁基）咪唑

榮維廣 宋寧慧 阮華 吳建 馬永建 吉文亮 劉華良

摘 要 建立了固相萃取法結(jié)合高效液相色譜同時(shí)檢測(cè)焦糖色素中2-甲基咪唑（2-Methylimidazole，2-MEI）、4-甲基咪唑（4-Methylimidazole，4-MEI）和2-乙?；?4-（1，2，3，4-四羥基丁基）咪唑（2-Acetyl-4-（1，2，3，4-tetrahydroxybutyl） imidazole，THI）的方法。樣品經(jīng)加水渦旋提取后，經(jīng)混合型強(qiáng)陽(yáng)離子交換固相萃取小柱富集凈化，以乙腈-0.05%氨水（10∶90， V/V）為流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min，用反向色譜柱Polaris C18-A （250 mm×4.6 mm，5 μm）柱分離，分別在二極管陣列檢測(cè)器215 nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)焦糖色素中的2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和287 nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)2-乙?；?4-（1，2，3，4-四羥基丁基）咪唑的含量。2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和2-乙?；?4-（1，2，3，4-四羥基丁基）咪唑在0.2～20 mg/L之間線性關(guān)系良好（r>0.9996），在10， 25和100 mg/kg添加濃度的回收率范圍為75.3%～93.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，檢出限分別為為2.6， 3.0和1.5 mg/kg，定量限分別為8.5， 10.0和5.0 mg/kg。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法； 焦糖色素； 2-甲基咪唑； 4-甲基咪唑； 2-乙酰基-4-（1，2，3，4-四羥基丁基）咪唑

1 引 言

焦糖色素是一種食品添加劑（俗稱(chēng)醬色），是一種濃紅褐色的膠體物質(zhì)，占整個(gè)食品著色劑銷(xiāo)量的90%以上【1】?？蓱?yīng)用于醬油、醋、醬菜、啤酒、罐頭、糖果、湯料、焙烤食品、烤煙及止咳糖漿等各個(gè)方面【2】。在焦糖色素的形成過(guò)程中主要發(fā)生兩大類(lèi)反應(yīng)——美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)【3】，其中普通焦糖色素的生產(chǎn)過(guò)程中主要發(fā)生焦糖化反應(yīng)，生產(chǎn)過(guò)程中加入氨（銨）催化劑的焦糖色素生產(chǎn)以美拉德反應(yīng)為主。研究發(fā)現(xiàn)，美拉德反應(yīng)過(guò)程中能夠產(chǎn)生許多對(duì)人體有害的化學(xué)物質(zhì)【4】，如2-甲基咪唑（2-Methylimidazole，2-MEI）、4-甲基咪唑（4-Methylimidazole，4-MEI）和2-乙?；?4-（1，2，3，4-四羥基丁基）咪唑（2-Acetyl-4-（1，2，3，4-tetrahydroxybutyl） imidazole，THI）。2-MEI 和4-MEI作為神經(jīng)毒素，具有強(qiáng)烈的致驚厥作用，美國(guó)國(guó)家毒品管理計(jì)劃和其它研究者已經(jīng)有明確的毒理學(xué)數(shù)據(jù)證明其具有致癌的風(fēng)險(xiǎn)【5～8】。2011年，國(guó)際腫瘤研究機(jī)構(gòu)（IARC）將甲基咪唑類(lèi)化合物認(rèn)定為2B類(lèi)致癌物【9】，而THI可引起免疫毒性【10，11】。鑒于咪唑類(lèi)化合物的毒性，歐盟委員會(huì)已經(jīng)對(duì)Ⅲ類(lèi)焦糖色素中THI和4-MEI建立了限量規(guī)定，分別為10和200 mg/kg【12】。因此，建立焦糖色素中2-MEI、4-MEI和THI的檢測(cè)方法對(duì)保證焦糖色素的品質(zhì)，乃至使用焦糖色素著色的包括食品在內(nèi)的眾多產(chǎn)品的品質(zhì)尤其重要。

焦糖色素是一種黑褐色粘稠液體或固體，基質(zhì)復(fù)雜。去除大量基質(zhì)的干擾成為準(zhǔn)確分析微量及痕量目標(biāo)物的關(guān)鍵。目前，針對(duì)焦糖色素中4-MEI含量的測(cè)定，我國(guó)唯有食品添加劑焦糖色衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB8817-2001【13】，采用薄層法測(cè)定，而對(duì)于2-MEI和THI的測(cè)定尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，也沒(méi)有限量規(guī)定。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)僅見(jiàn)2-MEI和4-MEI的檢測(cè)方法的報(bào)道【3，13～16】，對(duì)于THI檢測(cè)方法研究尚未見(jiàn)報(bào)道； 已建立的焦糖色素中2-MEI、4-MEI或THI的檢測(cè)方法所采用前處理方法主要有：柱層析【14，15】、液液萃取【16】、離子對(duì)萃取【17】、固相萃取【18，19】等。柱層析、液液萃取、離子對(duì)萃取操作繁瑣，不適合大批量樣品分析，且這些前處理方法用于THI提取凈化的報(bào)道較少。3種目標(biāo)物的的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法【13】、氣相色譜法【14】、液相色譜法【16】、離子色譜法【19】、毛細(xì)管電泳法【20】、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)【15】和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)【18，21】。其中的方法大多數(shù)都只能檢測(cè)2-MEI、4-MEI或THI中的1種或2種物質(zhì)。

本研究建立了一步固相萃取同時(shí)富集焦糖色素中3種目標(biāo)物2-MEI、4-MEI和THI，HPLC同時(shí)檢測(cè)的方法。與已報(bào)道的液相色譜方法相比，本方法的檢出限更低，線性范圍更寬，操作更簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度更高； 與已報(bào)道的液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)相比檢出限相當(dāng)，操作簡(jiǎn)單，分析成本更低，適合于對(duì)焦糖色素中2-MEI、4-MEI與THI同時(shí)檢測(cè)分析。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與試劑

1200 高效液相色譜儀（光電二極管陣列檢測(cè)器（DAD），Agilent美國(guó)公司），全自動(dòng)固相萃取儀（北京普立泰科儀器有限公司），氮?dú)鉂饪s儀（上海安譜科學(xué)儀器有限公司），渦旋快速混合器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司），純水儀（美國(guó)Millipore）。水系微孔濾膜（0.22 μm，南京榮華科學(xué)器材有限公司）； Oasis MCX固相萃取柱（3 mL/60 mg，美國(guó)Waters公司）； PLEXA PCX（3 mL/60 mg，美國(guó)Agilent公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，Merck公司）； HCl（優(yōu)級(jí)純，含量36%～38%，南京化學(xué)試劑有限公司）； 氨水為優(yōu)級(jí)純（含量25%～28%，南京化學(xué)試劑有限公司）； 2-MEI、4-MEI和THI標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥99.0%，西格瑪公司）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：分別精確稱(chēng)取2-MEI、4-MEI和THI標(biāo)準(zhǔn)品0.0125 g（精確至0.0001 g），用水分別溶解并定容至 25 mL，濃度均為0.5 g/L。貯備液置于4 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別吸取 2 mL 的2-MEI、4-MEI和THI標(biāo)準(zhǔn)貯備液于10 mL容量瓶中，用水定容，混勻，其濃度分別為100 mg/L。endprint

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別吸取適量標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 mg/L）于1.5 mL進(jìn)樣瓶中，用流動(dòng)相補(bǔ)足到1 mL。配制成2-MEI、4-MEI和THI的濃度分別為0.2， 0.5， 1.0， 2.0， 5.0， 10.0和20.0 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2-甲基咪唑、4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-（1，2，3，4-四羥基丁基）咪唑

2.3 試樣制備 稱(chēng)取焦糖色素樣品1 g（準(zhǔn)確至0.01 g），加水超聲溶解并定容至10 mL容量瓶中。取0.2 mL上述樣品溶液，加入0.1 mL 0.1 mol/L HCl，加水補(bǔ)足到2 mL，渦旋混勻后待固相萃取凈化。

2.4 樣品分析

2.4.1 固相萃取條件 將制備好的樣品溶液加入剛活化好的固相萃取小柱中（1 mL甲醇和1 mL水活化），上樣時(shí)控制流速小于0.5 mL/min，抽干，加入1 mL水和1 mL甲醇淋洗，控制流速小于1.0 mL/min，抽干，用3 mL氨水-甲醇（5∶95， V/V）洗脫收集，控制流速小于0.5 mL/min，抽干。將收集液在低于50 ℃條件下，氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?.0 mL流動(dòng)相定容，渦旋混合1 min，過(guò)0.22 μm水系微孔濾膜，濾液供HPLC測(cè)定。

2.4.2 液相色譜條件 色譜柱： Agilent Polaris C18-A色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相為乙腈-0.05%氨水（10∶90， V/V）； 流速：0.6 mL/min； 柱溫：30 ℃； 進(jìn)樣量：10 μL； DAD檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)：2-MEI和4-MEI為 215 nm； THI為287 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 流動(dòng)相和流動(dòng)相比例的優(yōu)化

甲醇和乙腈是反相色譜中常用的溶劑，但甲醇在低波長(zhǎng)下有紫外吸收，會(huì)降低分析方法的靈敏度，而乙腈截止波長(zhǎng)比甲醇低，更適合此次實(shí)驗(yàn)所用的215 nm檢測(cè)波長(zhǎng)，所以本研究選擇乙腈為流動(dòng)相。

考察了乙腈比例分別為5%， 10%， 20%， 40%的情況對(duì)峰形的影響，結(jié)果在10%條件下峰形最好，故選擇流動(dòng)相比例條件為乙腈-0.05%氨水（10∶90， V/V）。

3.2 固相萃取條件的優(yōu)化

3.2.1 固相萃取柱的選擇 比較了兩種陽(yáng)離子交換SPE（Solid-phase extraction）柱：Waters Oasis MCX（3 mL，60 mg，Waters公司）和Agilent PLEXA PCX（3 mL，60 mg，Agilent公司）的萃取效率。采用2 mL的上液量（分別含有0.5， 2.0和10.0 μg的2-MEI、4-MEI和THI），過(guò)柱后分別以3 mL氨水-甲醇（5∶95， V/V）洗脫，氮?dú)獯蹈珊髾z測(cè)2-MEI、4-MEI和THI的含量； 與添加量作比較，得出2-MEI、4-MEI和THI在兩種類(lèi)型固相萃取柱的回收率。由表1可知，2-MEI， 4-MEI和THI在Oasis MCX固相萃取柱上的萃取效率略好。

3.2.2 固相萃取上樣液酸度的優(yōu)化 強(qiáng)陽(yáng)離子交換固相萃取對(duì)上樣溶液的pH值有要求。本實(shí)驗(yàn)比較了0.02和0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)上樣溶液pH值：當(dāng)使用0.02 mol/L HCl調(diào)節(jié)樣品pH值時(shí)，個(gè)別樣品pH值仍較高，可達(dá)到4.3，此類(lèi)樣品的目標(biāo)物的回收率及穩(wěn)定性均稍差；而當(dāng)使用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)樣品pH值時(shí)，所有樣品pH<3.0，在此pH值下，在所有樣品中目標(biāo)物的回收率及穩(wěn)定性均稍好。因此，濃度選擇0.1 mol/L。

3.2.3 固相萃取洗脫溶劑及洗脫體積的優(yōu)化

Klejdus等【18】在固相萃取研究中使用了甲醇-5 mol/L HCl（3∶1， V/V）作為洗脫溶液，該洗脫溶劑中由于存在較多水，不僅不容易揮干，并且大量存在的Cl

將腐蝕對(duì)儀器設(shè)備，這是該方法的致命缺點(diǎn)。本研究采用氨水-甲醇（5∶95， V/V）進(jìn)行洗脫收集，方法準(zhǔn)確度和精密度均能滿足要求。

固相萃取中上液量采用2 mL（分別含有5.0 μg的2-MEI、4-MEI和THI），過(guò)柱后以氨水-甲醇（5∶95， V/V）進(jìn)行洗脫收集，每1 mL洗脫液?jiǎn)为?dú)收集，共收集5次。氮?dú)獯蹈珊髾z測(cè)洗脫液中2-MEI、4-MEI和THI含量。由表2可見(jiàn)，用3 mL洗脫液洗脫已能得到滿意結(jié)果，最終確定洗脫溶液體積為3 mL。表2 不同體積洗脫液中2-MEI、4-MEI和THI的含量NDNDNDND： 未檢出 （Not detected）。

3.3 方法評(píng)價(jià)

3.3.1 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

在選定的色譜條件下測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，得到2-MEI、4-MEI和THI的線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。由表3可知，在0.2～20 mg/L 線性范圍內(nèi)，2-MEI、4-MEI和THI均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.9996。圖1為2-MEI、4-MEI和THI標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，圖2為典型焦糖色樣品中的2-MEI、4-MEI和THI添加回收色譜圖。

本研究根據(jù)3倍信噪比（S/N=3）得到2-MEI、4-MEI和THI的最低檢出濃度為0.05、0.06和0.03 mg/L。當(dāng)稱(chēng)樣為1 g時(shí)，經(jīng)本研究確定的前處理方法處理后最終定容到1 mL檢測(cè)分析，得到2MEI、4-MEI和THI的檢出限分別為2.6， 3.0和1.5 mg/kg，根據(jù)10 倍信噪比（S/N=10）得到定量限分別為8.5， 10.0和5.0 mg/kg。方法的靈敏度能夠滿足食品添加劑焦糖色衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB 8817-2001【13】中規(guī)定的4-MEI限量的檢測(cè)要求及歐盟標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)【12】規(guī)定的4-MEI 和THI限量的檢測(cè)要求。

3.3.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度 本方法設(shè)置10， 25和100 mg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別選取Ⅲ類(lèi)焦糖色2份和Ⅳ類(lèi)焦糖色2份，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。2-MEI的平均回收率為80.4%～93.4%，4-MEI的平均回收率為80.2%～93.0%，THI的平均回收率為75.3%～84.6%，準(zhǔn)確度均較好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，結(jié)果見(jiàn)表4。

3.4 實(shí)際樣品分析

采用本方法對(duì)從全國(guó)焦糖色素生產(chǎn)廠家和市場(chǎng)流通環(huán)節(jié)所采集的69份焦糖色素樣品，其中包括

20份Ⅲ類(lèi)樣品和49份Ⅵ類(lèi)樣品，分別檢測(cè)2-MEI， 4-MEI和THI，檢出情況見(jiàn)表5。2-MEI共有7份樣品檢出，均低于100 mg/kg，未包含在表5中； 4-MEI以食品添加劑焦糖色衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB8817-2001【13】規(guī)定的限量200 mg/kg判定，Ⅲ類(lèi)和Ⅵ類(lèi)焦糖色素中4-MEI的超標(biāo)率分別為20%和18%； 對(duì)于THI我國(guó)尚無(wú)限量標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)歐盟標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)【12】的規(guī)定Ⅲ類(lèi)焦糖色素限量為10 mg/kg，Ⅲ類(lèi)焦糖色素中THI的超標(biāo)率為35%。

References

1 ZHANG Jin-Yun， ZENG Xiang-Yan. Chinese J. Modern Food Science and Technology， 2006， 22（3）： 67-69

張金云， 曾祥燕. 現(xiàn)代食品科技， 2006， 22（3）： 67-69

2 WANG Feng-Yun， PENG Yun-Long， LYU Jin-An， GU Jia-Shan. Chinese J. Chem. Educ.， 2013， 34（7）： 1-2

汪豐云， 呂金安， 顧家山. 化學(xué)教育， 2013， 34（7）： 1-2endprint