表面增強拉曼光譜結(jié)合乘子效應(yīng)模型對血漿和藥片中甲巰咪唑的定量檢測

胡敏　陳增萍 陳瑤　石彩霞　俞汝勤

摘 要 將表面增強拉曼散射（Surface-enhanced raman scattering，SERS）技術(shù)與乘子效應(yīng)模型結(jié)合，采用2-巰基異煙酸作為內(nèi)標，以銀納米顆粒為SERS增強基底，對血漿和藥片樣本中甲巰咪唑的進行準確的定量分析。實驗結(jié)果表明，本方法對血漿樣本中甲巰咪唑的平均相對預(yù)測誤差為5.1%，檢出限為32 nmol/L；對藥片中甲巰咪唑的定量結(jié)果與LC-MS/MS方法基本一致，其加標回收率在93.3%～110.9%之間。

關(guān)鍵詞 表面增強拉曼光譜； 甲巰咪唑； 2-巰基異煙酸； 乘子效應(yīng)模型； 定量分析

1 引 言

甲巰咪唑為抗甲狀腺藥物，一般用于各種類型的甲狀腺功能亢進癥【1，2】的治療。但該藥物的使用不當或者過量使用會產(chǎn)生一定的副作用，輕則出現(xiàn)粒細胞減少，脫發(fā)、皮炎等，重則可能導(dǎo)致中毒性肝損傷。因此，必須在甲巰咪唑的生產(chǎn)和使用過程進行嚴格的定量監(jiān)控。目前，甲巰咪唑的定量分析方法有液相色譜法【3，4】、氣相色譜-質(zhì)譜法【5，6】、電化學(xué)方法【7，8】和間接流動注射法【9】等。但是，這些方法均具有一定的局限性：需要對復(fù)雜實際樣品進行繁瑣費時的預(yù)處理，或者所需儀器價格昂貴且體積龐大，不適用于大量樣品的快速在線分析。因此， 建立一種新型簡便、快速、靈敏的甲巰咪唑的定量方法仍具有較重要的現(xiàn)實意義。

表面增強拉曼散射技術(shù)（Surface-enhanced raman scattering，SERS）具有光譜特征性強、靈敏度高、制樣簡單，以及檢測快捷等優(yōu)點【10～15】。但是，樣本的SERS信號強度不但取決于待測樣本中待測物質(zhì)的濃度，而且與SERS增強基底物理性質(zhì)（如納米銀或金膠體的形狀、粒徑以及聚集度等）有關(guān)。而常用SERS增強基底銀（金）納米溶膠的可重現(xiàn)性和穩(wěn)定性均較差，嚴重影響樣本SERS信號的重現(xiàn)性，導(dǎo)致SERS定量分析結(jié)果的精確度遠遠不到實際定量分析的要求。最近，本研究小組發(fā)展了一個適用于表面增強拉曼光譜定量分析的乘子效應(yīng)模型（Multiplicative effects model for surface-enhanced raman spectroscopy， MEMSERS）【16，17】。 MEMSERS模型能夠有效消除SERS增強基底物理性質(zhì)變化對SERS定量分析結(jié)果準確度的影響。本研究將SERS技術(shù)與MEMSERS相結(jié)合，實現(xiàn)了血漿和藥片中甲巰咪唑含量的快速準確定量分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

便攜式i-拉曼785H光譜儀（上海必達泰克光電科技有限公司）；1290液相色譜/G6460B系列三級四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫科技有限公司）；C18反相色譜柱（150 mm×2.1 mm， 3.5 μm）。

二水合檸檬酸三鈉（C6H5Na3O7·2H2O）和AgNO3（Sigma-Aldrich 試劑有限公司）。正常人血漿從雙流正龍生化制品研究室（長沙）獲得。甲巰咪唑和2-巰基異煙酸（阿拉丁公司）。甲巰咪唑藥片（北京燕京藥業(yè)有限公司）。實驗用水均為超純水（18.2 MΩ cm），直接從艾科浦純水系統(tǒng)（艾科浦公司）中取用。所有試劑均為分析純。

2.2 SERS增強基底銀納米顆粒的制備

實驗中所用玻璃器皿均在王水（HCl-HNO3， 3∶1， V/V）中浸泡8 h以上，用超純水沖洗，烘干后使用。本研究中所用銀納米溶膠是按照Lee-Meisel方法【18】制備：稱取18 mg AgNO3， 用水溶解并定容至100 mL；將此溶液轉(zhuǎn)至圓底燒瓶并加熱至沸騰后，迅速加入2 mL檸檬酸三鈉溶液（1%），保持沸騰并繼續(xù)回流1 h后停止加熱，使溶液自然冷卻至室溫，裝瓶待用。

2.3 樣品的制備

分別用超純水和乙醇溶解適量的甲巰咪唑和2-巰基異煙酸，得到5.50 mmol/L甲巰咪唑儲備液和0.31 mmol/L 2-巰基異煙酸儲備液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ迫?0 μL 2-巰基異煙酸儲備液和不同體積的甲巰咪唑儲備液，用水稀釋至0.50 mL，得到11個甲巰咪唑校正樣本，其中甲巰咪唑的濃度分別為0.06， 0.18， 0.37， 0.55， 0.73， 0.92， 1.10， 1.28， 1.47， 1.65和1.83 μmol/L。

移取1.00 mL正常人血漿（用LC-MS/MS沒有檢測出甲巰咪唑）于10.0 mL離心管中，用乙腈稀釋至8.0 mL，于20 ℃以10000 r/min離心20min； 吸取4.00 mL 上清液，定容至50.0 mL，備用。移取10 μL 2-巰基異煙酸儲備液與適量甲巰咪唑儲備液，用上述血漿上清液稀釋至0.5 mL，得到甲巰咪唑濃度分別為0.28， 0.46， 0.83， 1.01， 1.19， 1.38和1.74 μmol/L的血漿預(yù)測樣本（對每個甲巰咪唑濃度水平，均配制3個重復(fù)血漿樣本）。

準確稱取一片甲巰咪唑藥片（0.0721 g），用水溶解并定容至50.0 mL，再以水將其稀釋50倍，得到甲巰咪唑藥片儲備液。如表1所示，將20 μL藥片儲備液與10 μL 2-巰基異煙酸儲備液和適量甲巰咪唑儲備液混合后用超純水稀釋至0.5 mL，得到藥片預(yù)測集樣本。

2.4 樣本SERS光譜的采集

將10 μL樣本、50 μL的銀納米顆粒（AgNPs）、以及2.5 μL 2 mol/L KCl混勻后，立即用毛細管取樣，使用耦合了BAC151A拉曼影像顯微鏡采樣系統(tǒng)的便攜式i-Raman 785H光譜儀采集其SERS光譜。樣本SERS光譜采集參數(shù)如下：拉曼位移范圍500～1600 cm

激光波長785 nm，激光功率300 mW，物鏡倍數(shù)20倍，曝光時間5 s。每個樣品均重復(fù)測量3次。

2.5 LC-MS/MS實驗endprint

為了驗證SERS 技術(shù)結(jié)合MEMSERS模型對藥片預(yù)測集樣本中甲巰咪唑含量預(yù)測結(jié)果的準確性，本研究采用1290液相色譜/G6460B系列三級四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀對藥片預(yù)測集中的9個樣本中甲巰咪唑的含量進行了檢測。每個樣本均重復(fù)檢測3次。具體的色譜與質(zhì)譜實驗條件如下： C18反相色譜柱（150 mm×2.1 mm， 3.5 μm），流動相為0.1%甲酸-甲醇（1∶1，V/V），流速0.3 mL/min，進樣量20 μL，質(zhì)譜離子源：電噴霧離子源，檢測模式：正離子多重反應(yīng)監(jiān)測模式，母離子：m/z 115.0 （其最優(yōu)電壓值為102 V），子離子：m/z 57.2和88.0 （其最優(yōu)的碰撞電壓分別為18和15 V），掃描時間：300 ms。表1 藥片預(yù)測樣本的實驗設(shè)計范圍內(nèi)的SERS光譜數(shù)據(jù)進行后續(xù)的定量分析。

由于樣本的SERS光譜信號強度除了與待測分析物濃度有關(guān)之外，還會受SERS增強基底（如銀納米顆粒）物理性質(zhì)變化的影響，這使得樣本的SERS光譜信號強度與待測分析物的濃度之間的關(guān)系常不為簡單的線性關(guān)系。本研究采用如下MEMSERS模型對甲巰咪唑樣本的表面增強拉曼光譜進行定量分析。

xk=bk·（c2-MNA，k·r2-NMA+cMMI，k·rMMI）+dk k=1，2，......K（1）

其中，xk代表第k個校正樣本的SERS光譜；c2-MNA， k和cMMI， k分別代表第k個校正樣本中2-巰基異煙酸和甲巰咪唑的濃度；r2-MNA和rMMI分別代表2-巰基異煙酸和甲巰咪唑分子的拉曼散射特性；乘子參數(shù)bk代表SERS增強基底物理性質(zhì)等因素變化對第k個校正樣本的SERS光譜信號產(chǎn)生的乘子效應(yīng)；dk代表背景干擾和SERS增強基底物理性質(zhì)變化對第k個校正樣本SERS光譜信號產(chǎn)生的非乘子效應(yīng)。由于內(nèi)標物2-巰基異煙酸在每個樣本中的濃度c2-MNA， k是固定不變的，因此MEMSERS模型中校正樣本的乘子參數(shù)bk（k=1， 2， …， K）可以用改進光程估計與糾正的方法（Modified optical path length estimation and correction， OPLECm）【17】估計出來。獲得乘子參數(shù)bk（k=1， 2， …， K）后，采用多元校正方法（如Partial least squares regression， PLSR）在xk與bk之間，以及xk與bk·cMMI，k之間建立兩個校正模型。獲得待測樣本的SERS光譜xtest后，待測樣本中甲巰咪唑的濃度可以由第二個校正模型的預(yù)測值除以第一個校正模型的預(yù)測值而獲得。

本研究將用水配制的甲巰咪唑校正集樣本的SERS光譜作為校正集，在其上建立MEMSERS和PLSR校正模型，然后將所建立的MEMSERS和PLSR校正模型用于預(yù)測血漿預(yù)測集樣本和藥片預(yù)測集樣本中甲巰咪唑的濃度。MEMSERS和PLSR校正模型中使用的最優(yōu)潛變量數(shù)均采用交互驗證法確定。采用預(yù)測均方根誤差（RMSEP）：

RMSEP=Nk=1（cMMI，k-MMI，k）2/N（2）

cMMI， k和MMI， k分別代表第k個待測樣本中甲巰咪唑的真實濃度和預(yù)測濃度；N代表待測樣本的數(shù)目）。平均相對預(yù)測誤差（ARPE）：

ARPE=1NNi=1（cMMI，k-MMI，k）/cMMI，k×100%（3）

采用RMSEP和ARPE評價和比較MEMSERS與PLSR校正模型的預(yù)測結(jié)果。

3 結(jié)果與討論

3.1 內(nèi)標濃度的優(yōu)化

采用內(nèi)標加入法對待測樣本中的甲巰咪唑進行SERS定量分析。內(nèi)標物2-巰基異煙酸（其SERS特征峰數(shù)量少且信號較強）和待測分析物2-巰基異煙酸均含有巰基，它們可通過與銀納米顆粒表面形成穩(wěn)定的AgS鍵而修飾在銀納米顆粒表面。由于甲巰咪唑與2-巰基異煙酸之間可能存在對銀納米顆粒表面上結(jié)合位點的競爭現(xiàn)象，作為內(nèi)標物加入的2-巰基異煙酸的濃度若太低，則其SERS信號太弱，起不到內(nèi)標作用；但2-巰基異煙酸濃度也不能太高，否則會影響甲巰咪唑的檢測靈敏度。為了實現(xiàn)對本研究所考察濃度范圍內(nèi)的甲巰咪唑進行較準確的定量分析，將所加入的2-巰基異煙酸的濃度設(shè)置為一個比較適中的值，即6.2 μmol/L。

3.2 增強基底物理物質(zhì)對樣本SERS光譜信號的影響

在SERS定量分析過程中遇到的最大問題是：樣本的SERS光譜信號重現(xiàn)性較差。如圖2所示，在其它實驗條件完全一樣的情況下，將激光聚焦在同一根取樣毛細管（毛細管中裝有同一銀納米顆粒-KCl-樣本混合物）中不同位置所獲得一組SERS光譜之間存在明顯差異。這主要是由SERS增強基底納米銀顆粒的形狀和大小分布不均勻所致。由OPLECm所估計出來的甲巰咪唑校正集樣本的乘子參數(shù)bk在1.0～2.6范圍內(nèi)變動，表明SERS增強基底納米銀顆粒的形狀和大小分布不均勻性對樣本SERS光譜信號有很大影響。必須采取措施消除這種不利影響，才能實現(xiàn)對血漿預(yù)測集樣本和藥片預(yù)測集樣本中甲巰咪唑的準確定量分析。

3.3 樣品分析

3.3.1 血漿樣本中甲巰咪唑的定量分析 將建立在用水配制的甲巰咪唑校正集樣本SERS光譜數(shù)據(jù)上的MEMSERS和PLSR校正模型應(yīng)用于血漿預(yù)測集樣本中甲巰咪唑濃度的定量分析。如表2所示，PLSR模型的RMSEP和ARPE值分別為0.13 μmol/L和11.0%。PLSR模型預(yù)測值與實際值之間的偏差相對較大。此外，PLSR模型對同一樣本的3次重復(fù)測量SERS光譜的定量分析結(jié)果的標準方差較大。這些現(xiàn)象表明， PLSR模型不能有效消除SERS增強基底物理性質(zhì)的不均一性對SERS定量分析結(jié)果的不利影響。相比之下，MEMSERS模型給出的甲巰咪唑濃度的預(yù)測值與實際值非常接近，而且其對同一樣本的3次重復(fù)測量SERS光譜的定量分析結(jié)果的標準方差也較小。MEMSERS的RMSEP和ARPE值分別為0.05 μmol/L和5.1%，均明顯小于PLSR模型的相應(yīng)值。另外，通過估算得到MEMSERS對血漿體系中甲巰咪唑的檢出限為32 nmol/L，優(yōu)于文獻中采用的氣相色譜-質(zhì)譜法的檢出限（45 nmol/L）【5， 6】。endprint

為了驗證MEMSERS模型預(yù)測結(jié)果的可靠性，采用另一份正常人的血漿（新血漿），按照上述血漿預(yù)測樣本的配制方法重新配制一組血漿預(yù)測樣本，并使用建立的MEMSERS模型對這一組血漿預(yù)測樣本中的甲巰咪唑濃度進行定量分析。結(jié)果表明，MEMSERS模型的預(yù)測結(jié)果的準確度很高，其RMSEP和ARPE值分別為0.06 μmol/L和5.4%，與前面所獲得結(jié)果幾乎完全一致。因此，待測樣本基質(zhì)的變化也不影響MEMSERS對血漿預(yù)測集樣本中甲巰咪唑的定量分析結(jié)果。

3.3.2 藥片中甲巰咪唑的定量分析 SERS技術(shù)結(jié)合MEMSERS模型和LC-MS/MS對一片藥片中甲巰咪唑含量的測定值分別為5.4和5.0 mg。這兩種方法的檢測結(jié)果基本一致，并且十分接近該藥片所附說明書上標注的規(guī)格（5 mg/片）。表3列出了MEMSERS和 LC-MS/MS對藥片預(yù)測集樣本中甲巰咪唑的定量分析結(jié)果。從表3可知，MEMSERS定量分析結(jié)果的平均加標回收率在93.3%～110.9%之間，與LC-MS/MS定量分析結(jié)果的準確度基本一致，表明SERS技術(shù)結(jié)合MEMSERS模型方法能準確測定復(fù)雜體系中甲巰咪唑的含量，并且有望發(fā)展成為復(fù)雜體系中甲巰咪唑含量的常規(guī)定量分析方法。表3 MEMSERS和 LC-MS/MS對藥片預(yù)測樣本中甲巰咪唑的定量分析結(jié)果

4 結(jié) 論

采用了MEMSERS模型消除SERS增強基底物理性質(zhì)的不均一性對SERS定量分析結(jié)果的不利影響，以實現(xiàn)血漿和藥片樣本中甲巰咪唑的準確定量檢測。結(jié)果表明，建立在超純水配制的甲巰咪唑校正集樣本SERS光譜數(shù)據(jù)上的MEMSERS模型能夠從血漿預(yù)測集樣本和藥片預(yù)測集樣本的SERS光譜中準確預(yù)測出相應(yīng)甲巰咪唑的含量。MEMSERS對血漿預(yù)測集樣本中甲巰咪唑含量的平均相對預(yù)測誤差約為5.1%，檢出限達到了32 nmol/L，而且待測樣本的基質(zhì)變化不影響MEMSERS定量分析結(jié)果的準確度；MEMSERS模型對藥片預(yù)測集樣本中甲巰咪唑含量的預(yù)測結(jié)果的回收率在93.3%～110.9%之間，與LC-MS/MS對照實驗的結(jié)果基本一致。SERS技術(shù)與MEMSERS模型相結(jié)合檢測甲巰咪唑的方法具有簡便、快捷、靈敏度高、檢出限低的特點，有望發(fā)展成為復(fù)雜體系中甲巰咪唑含量的常規(guī)定量分析方法。

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