毛細(xì)管電泳法在酶抑制劑篩選中的應(yīng)用

劉冬梅 師彥平 陳娟

摘 要 毛細(xì)管電泳法以其分離效率高、耗時(shí)短、樣品用量少、靈敏度高以及易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等諸多特點(diǎn)，在篩選酶抑制劑研究中有著不可替代的優(yōu)勢(shì)。本文綜述了毛細(xì)管電泳法在酶抑制劑篩選中的應(yīng)用。主要介紹了應(yīng)用最廣泛的離線分析（Off-line assay）和在線分析（In-line assay），即柱前酶反應(yīng)（Pre-capillary enzyme reaction）和在柱酶分析（In-capillary enzyme reaction）。并對(duì)該領(lǐng)域的未來(lái)發(fā)展進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞 毛細(xì)管電泳； 酶抑制劑； 柱前酶反應(yīng)； 在柱酶反應(yīng)； 綜述

1 引 言

人類疾病的產(chǎn)生往往與體內(nèi)各種酶的異常表達(dá)有關(guān)，如果酶的活性異常高于正常水平，則會(huì)引起機(jī)體功能紊亂，引發(fā)疾病的產(chǎn)生。如乙酰膽堿酯酶（AChE）過(guò)多，則會(huì)過(guò)度分解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，從而引起阿爾茨海默癥（老年癡呆癥）和肌無(wú)力【1】； 酪氨酸酶（TRS）是黑色素合成的關(guān)鍵酶和限速酶，TRS活性過(guò)高則會(huì)引起黑色素沉積，引發(fā)皮膚色素性疾病【2】。通過(guò)抑制關(guān)鍵酶來(lái)干預(yù)治療已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)很有吸引力的戰(zhàn)略，目前有相當(dāng)一部分臨床藥物來(lái)自酶抑制劑【3】。

酶抑制劑篩選的傳統(tǒng)途徑有放射性同位素法、薄層色譜法、電化學(xué)法、分光光度法和高效液相色譜法等，這些方法雖然已經(jīng)非常成熟，但是仍然存在一些不可避免的缺陷【4】。毛細(xì)管電泳法以其分離效率高、耗時(shí)短、樣品用量少、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等諸多特點(diǎn)，特別是高效分離機(jī)制，在酶抑制劑篩選中顯示出傳統(tǒng)方法無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。而且，毛細(xì)管電泳法可以結(jié)合多種檢測(cè)方法，如紫外、激光誘導(dǎo)熒光、質(zhì)譜、電化學(xué)以及輻射檢測(cè)【5】等進(jìn)行目標(biāo)物的分析，其中，紫外檢測(cè)以其成本低、操作方便、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)成為最廣泛使用的檢測(cè)方法。

毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)的靈敏度受到待分析物濃度的限制。通過(guò)增加檢測(cè)光程或樣品濃縮富集可提高檢測(cè)靈敏度【6】，例如改變檢測(cè)池的幾何形狀，包括泡形池、Z形池和多次反射池來(lái)增加檢測(cè)光程，以及零電壓效應(yīng)、樣品堆積、場(chǎng)放大堆積和場(chǎng)放大進(jìn)樣等濃縮富集技術(shù)提高檢測(cè)的靈敏度。Iqbal等【7】在監(jiān)測(cè)核苷酸焦磷酸酶和磷酸二酯酶的反應(yīng)時(shí)，在內(nèi)壁涂層為聚凝胺陽(yáng)離子的毛細(xì)管內(nèi)，將聚凝胺加到緩沖溶液中，利用產(chǎn)物與聚凝胺電遷移方向相反，使得產(chǎn)物堆積來(lái)提高檢測(cè)靈敏度。也可以通過(guò)將樣品溶解在水中，或者采用稀釋的緩沖液使樣品堆積【8】。

毛細(xì)管電泳法篩選酶抑制劑主要有4種形式：柱前酶反應(yīng)（Pre-capillary enzyme reaction）、毛細(xì)管進(jìn)樣端反應(yīng)（At-inlet reaction）、電泳中介微分析（EMMA）、層流剖面的橫向擴(kuò)散（TDLFP）技術(shù)， 其中，At-inlet、EMMA和TDLFP都屬于在柱酶反應(yīng)（In-capillary enzyme reaction）。下面將對(duì)這幾種形式進(jìn)行總結(jié)論述。

2 柱前酶反應(yīng)

離線分析（Off-line assay）就是反應(yīng)物首先在毛細(xì)管之外混合，加入底物、酶或輔酶引發(fā)反應(yīng)，經(jīng)特定時(shí)間的孵育之后采取適當(dāng)?shù)姆椒ㄢ缑复俜磻?yīng)，然后將樣品注入毛細(xì)管電泳中進(jìn)行分離檢測(cè)，通過(guò)測(cè)定產(chǎn)物或是底物的峰面積變化來(lái)進(jìn)行酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、抑制動(dòng)力學(xué)的研究以及抑制劑的篩選【9，10】。在柱前酶反應(yīng)中，毛細(xì)管電泳只作為分離系統(tǒng)使用。

辛志宏等【11】利用毛細(xì)管離線分析測(cè)定了血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑Captopril的活性，優(yōu)化了反應(yīng)、分離條件，可以準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速的分析Captopril的抑制活性，并且為進(jìn)一步篩選血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑提供了篩選模型。栗娜等【12】利用毛細(xì)管電泳法測(cè)定了雞肝二氫葉酸還原酶的活力，測(cè)定已知抑制劑的半數(shù)抑制濃度，與文獻(xiàn)數(shù)值相比較，證明該體系可用于二氫葉酸還原酶抑制劑的篩選。賈蕊等【13】使用柱前酶反應(yīng)與EMMA進(jìn)行了二氫葉酸還原酶抑制劑的篩選，比較兩種反應(yīng)模式所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)柱前反應(yīng)模式檢測(cè)靈敏度高，遷移時(shí)間和峰面積重現(xiàn)性好，并且易于控制。種蕾等【14】由可口革囊星蟲(chóng)粗提物中篩選出7種對(duì)神經(jīng)氨酸酶有抑制活性的粗提物，實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化了反應(yīng)和分離分析條件，建立的模型可用于復(fù)雜體系中抗流感病毒藥物神經(jīng)氨酸酶抑制劑的篩選。Iqbal等【15】使用離線毛細(xì)管電泳法篩選和鑒定了腺苷激酶的抑制劑和底物。實(shí)驗(yàn)中底物和產(chǎn)物可以高效分離，使用標(biāo)準(zhǔn)抑制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，與標(biāo)準(zhǔn)放射方法相比，兩者抑制動(dòng)力學(xué)常數(shù)Ki相近，證明了建立的篩選模型的可靠性和準(zhǔn)確性。Chen等【16】測(cè)定了20S蛋白酶對(duì)多肽底物MG132和MG115的實(shí)時(shí)水解，以及一系列化合物對(duì)其抑制效果。37 ℃下混合底物和酶溶液引發(fā)酶促反應(yīng)，冰浴中浸沒(méi)10 min猝滅反應(yīng)，離心后將上清液注入毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行分離檢測(cè)。李冰等【17】使用蛋白-脂質(zhì)體復(fù)合物進(jìn)行柱外篩選單胺氧化酶（MAO）抑制劑，通過(guò)加入含EDTA和Na2S2O5的HClO4溶液猝滅反應(yīng)，與傳統(tǒng)的MAO抑制劑篩選方法相比簡(jiǎn)單、快速、節(jié)省酶源、干擾因素少。Bryant等【18】使用此模式研究了乙酰輔酶A羧化酶，實(shí)驗(yàn)中將生物素羧化酶和羧基轉(zhuǎn)移酶加入含有抑制劑的反應(yīng)混合物中，反應(yīng)一段時(shí)間將混合物注入毛細(xì)管中分離。該研究允許同時(shí)篩選生物素羧化酶和羧基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑。Iqbal等【19】使用柱前酶反應(yīng)進(jìn)行了碳酸酐酶的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和抑制反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究。他們將碳酸酐酶和底物4-硝基苯基乙酸酯在37 ℃下孵育10 min，降溫終止反應(yīng)，隨后將反應(yīng)混合物注入毛細(xì)管內(nèi)，施加電壓進(jìn)行產(chǎn)物4-硝基苯酚的分離檢測(cè)。Malina等【20】也使用了柱前酶反應(yīng)進(jìn)行磷酸果糖激酶-1的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和抑制反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，使用毛細(xì)管電泳進(jìn)行產(chǎn)物與底物的分離，減少了抑制劑對(duì)產(chǎn)物的干擾，從而減少了假陽(yáng)性，所得半數(shù)抑制濃度與耦合分光光度法相符。

離線分析中酶促反應(yīng)和毛細(xì)管電泳分離是兩個(gè)獨(dú)立的體系，因此其條件可以分別優(yōu)化，不會(huì)對(duì)彼此產(chǎn)生干擾。但該方法存在局限性：第一，酶促反應(yīng)很快，所以混合物在注入毛細(xì)管之前，必須通過(guò)加入試劑或者改變反應(yīng)條件來(lái)猝滅反應(yīng)； 第二，盡管毛細(xì)管分離檢測(cè)只需要納升級(jí)的樣品量，但是引發(fā)反應(yīng)仍需要大量反應(yīng)物，造成試劑浪費(fèi)。在柱酶反應(yīng)模式的出現(xiàn)彌補(bǔ)了上述不足。endprint

3 在柱酶反應(yīng)

在柱酶反應(yīng)，毛細(xì)管不僅可以用作分離通道，同時(shí)也可以用作反應(yīng)容器，酶可以被固定，或以自由酶存在于溶液中。該模式具有以下優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)溶液體積只需納升級(jí)【21】，與柱前反應(yīng)相比減少了試劑用量，大大降低了分析成本； 集進(jìn)樣、混合、反應(yīng)、分離和檢測(cè)于一個(gè)封閉的毛細(xì)管內(nèi)，提高了分析效率； 有利于實(shí)現(xiàn)酶分析的自動(dòng)化和微型化【22】。在柱酶反應(yīng)可以分為EMMA、At-inlet和TDLFP三類。

3.1 電泳中介微分析（EMMA）

為解決柱前酶反應(yīng)中樣品消耗量大、無(wú)法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等缺陷，Bao和Regnier【23】首次報(bào)導(dǎo)了在線電泳酶分析，該模式后來(lái)被命名為電泳中介微分析（EMMA）。EMMA是在電場(chǎng)作用下利用反應(yīng)物在緩沖液中表觀遷移速率的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)反應(yīng)物在柱內(nèi)混合，從而引發(fā)酶促反應(yīng)，隨后反應(yīng)物和產(chǎn)物在毛細(xì)管內(nèi)被分離為獨(dú)立的區(qū)帶至檢測(cè)器被檢測(cè)。在該模式中，酶與試劑的混合是在電場(chǎng)作用下的混合，無(wú)額外稀釋和區(qū)帶展寬效應(yīng)。根據(jù)電場(chǎng)下反應(yīng)物在毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)樣和混合模式，EMMA可以分為兩類，即連續(xù)模式和區(qū)帶-區(qū)帶模式。

3.1.1 連續(xù)模式

連續(xù)模式是毛細(xì)管內(nèi)預(yù)先充滿一種反應(yīng)物，根據(jù)第二種反應(yīng)物的注射方式可分為兩類：帶狀注射法（圖1A）和移動(dòng)界面注射法。Bao和Regnier【23】發(fā)展了帶狀注射法，并以葡萄糖-6-磷酸脫氫酶為模型對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。毛細(xì)管內(nèi)預(yù)先充滿含有底物葡萄糖-6-磷酸和輔酶NADH的運(yùn)行緩沖液，酶溶液獨(dú)立存在于一個(gè)進(jìn)樣瓶中，以區(qū)帶模式進(jìn)樣，反應(yīng)物在電場(chǎng)作用下混合引發(fā)酶促反應(yīng)，隨后反應(yīng)物和產(chǎn)物在毛細(xì)管內(nèi)被分離為獨(dú)立的區(qū)帶至檢測(cè)器被檢測(cè)。Harmon等【24】發(fā)展了移動(dòng)界面注射法，以亮氨酸氨肽酶為模型對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。毛細(xì)管內(nèi)預(yù)先充滿遷移速度小的酶溶液，遷移速度大的底物L(fēng)-亮氨酸-4-硝基苯胺溶液保存于進(jìn)樣端的緩沖液儲(chǔ)液瓶中連續(xù)進(jìn)樣。帶狀注射法中，第二種反應(yīng)物一旦進(jìn)樣就不會(huì)再有新的反應(yīng)物進(jìn)入毛細(xì)管內(nèi)，而移動(dòng)界面注射法在整個(gè)運(yùn)行過(guò)程中都有新的底物注入毛細(xì)管內(nèi)，從而增加了底物與酶的接觸時(shí)間，增加產(chǎn)物產(chǎn)量，提高檢測(cè)靈敏度。

3.1.2 區(qū)帶-區(qū)帶模式 根據(jù)毛細(xì)管內(nèi)孵育緩沖液和背景電解質(zhì)溶液的異同，區(qū)帶-區(qū)帶模式可以分為兩類，即經(jīng)典區(qū)帶-區(qū)帶模式和部分填充模式。

經(jīng)典區(qū)帶-區(qū)帶模式（圖1B）中反應(yīng)緩沖液和分離緩沖液為同一種緩沖液，預(yù)先在毛細(xì)管內(nèi)充滿緩沖液，然后按照表觀遷移速度由小到大的順序?qū)⒎磻?yīng)物以區(qū)帶模式注入毛細(xì)管內(nèi)。施加較小的電壓之后，表觀遷移速度大的反應(yīng)物在毛細(xì)管內(nèi)流速快，與表觀遷移速度小的反應(yīng)物混合重疊，從而引發(fā)酶促反應(yīng)?？梢酝ㄟ^(guò)關(guān)閉電壓來(lái)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，從而增加產(chǎn)物量，提高檢測(cè)靈敏度。經(jīng)孵育之后，增加電壓分離產(chǎn)物和殘余反應(yīng)物。

與連續(xù)模式相比，區(qū)帶-區(qū)帶模式只需要一小段的反應(yīng)物，反應(yīng)物用量少，反應(yīng)成本低，因此區(qū)帶-區(qū)帶模式是EMMA中最常用的。然而，在經(jīng)典區(qū)帶-區(qū)帶模式中，緩沖液既要有利于酶促反應(yīng)進(jìn)行，又要有利于產(chǎn)物和反應(yīng)物的分離，因此仍存在一定的局限性。van Dyck等【25】在研究牛血清胺氧化酶時(shí)，發(fā)現(xiàn)酶在背景電解質(zhì)溶液中不能穩(wěn)定存在，因此提出了部分填充模式，即毛細(xì)管的一部分填充有利于酶促反應(yīng)的孵育緩沖液，剩余部分填充背景電解質(zhì)溶液來(lái)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物和反應(yīng)物的分離。一般，為了防止背景電解質(zhì)溶液對(duì)酶促反應(yīng)體系產(chǎn)生干擾，則在反應(yīng)物之前注入一小段孵育緩沖液將酶與背景電解質(zhì)溶液隔開(kāi)（圖1C）。

EMMA在篩選中藥提取物中酶抑制劑時(shí)具有很大優(yōu)勢(shì)。由于α-葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)體系最適孵育緩沖液為磷酸緩沖液（pH 7.0），而有利于產(chǎn)物和反應(yīng)物分離的最適分離緩沖液硼砂（pH 9.2）對(duì)酶有滅活作用，所以EMMA部分填充技術(shù)被應(yīng)用于α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選【26】。盡管有報(bào)導(dǎo)稱電場(chǎng)作用下混合兩種以上的反應(yīng)物優(yōu)化過(guò)程繁瑣而且不切實(shí)際【27】，但是，Zhang等【5】在對(duì)細(xì)胞色素P450進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究時(shí)成功地發(fā)展了在柱電泳混合3個(gè)反應(yīng)物區(qū)帶的方法。Zhao等【28】借鑒此方法由中藥中篩選了芳香化酶抑制劑，毛細(xì)管內(nèi)樣品注射順序?yàn)檩o酶、孵育緩沖液、芳香化酶、抑制劑和底物混合液，施加電壓混合反應(yīng)物，通過(guò)產(chǎn)物的峰面積來(lái)確定酶活，以及篩選抑制劑。此外，在對(duì)甘油激酶進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，Nehmé等【29】在EMMA部分填充技術(shù)的基礎(chǔ)上首次發(fā)展了在線混合至少4個(gè)反應(yīng)物區(qū)帶的方法，反應(yīng)物的注射順序?yàn)椋悍跤彌_液、抑制劑、ATP、甘油激酶、甘油，這種方法避免了預(yù)先混合底物和抑制劑這一步驟，從而減小了工作量。

為了提高EMMA的分離速度和靈敏度，Sanders等【30】基于區(qū)帶-區(qū)帶模式提出了快速轉(zhuǎn)換電壓極性的電泳中介微分析，如圖1D所示：順序進(jìn)樣酶和底物，底物的表觀遷移速度較大，因此兩者混合； 然后反轉(zhuǎn)電極，酶和底物與原來(lái)相比反向遷移，因此底物與酶分離； 反轉(zhuǎn)電極，底物與酶再次混合。此模式中，由于兩種反應(yīng)物的表觀遷移速度的不同，當(dāng)交替施加正負(fù)電壓時(shí)，反應(yīng)物持續(xù)快速混合，進(jìn)而增加產(chǎn)物產(chǎn)量。

圖1 在線分離的模式，（A）EMMA連續(xù)模式； （B）經(jīng)典區(qū)帶-區(qū)帶模式； （C）部分填充模式； （D）快速切換電極EMMA； （E）進(jìn)樣端軸向擴(kuò)散模；（F）層流剖面的橫向擴(kuò)散【31】

4 結(jié) 論

毛細(xì)管電泳作為一種高效、快速的分離技術(shù)，近年來(lái)在酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和抑制動(dòng)力學(xué)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用并得以快速發(fā)展。離線分析中可以對(duì)酶促反應(yīng)條件和分離條件分別進(jìn)行優(yōu)化，因此限制因素少。在線分析集進(jìn)樣、混合、反應(yīng)、分離和檢測(cè)于一體，簡(jiǎn)化了操作步驟，縮短了分析時(shí)間，與離線分析相比，不僅可以減少試劑消耗，而且可以實(shí)現(xiàn)酶反應(yīng)和檢測(cè)的自動(dòng)化和微型化。毛細(xì)管電泳法尤其是在線分析的優(yōu)勢(shì)，使其廣泛地應(yīng)用于酶抑制劑的篩選中。綜上，在線分析的各種模式都具有各自的優(yōu)勢(shì)，但仍存在一些不足：如電泳中介微分析中酶不能夠被重復(fù)利用，與固定化酶微反應(yīng)器相比也造成了試劑浪費(fèi)； 但毛細(xì)管在線固定化酶微反應(yīng)器又不能適用于反應(yīng)緩沖液和分離緩沖液不同的酶促反應(yīng)體系，而且各種固定方法也存在各自的缺陷； 層流剖面的橫向擴(kuò)散優(yōu)化條件繁瑣，而且不能消除由緩沖液造成的稀釋效應(yīng)。因此，今后的發(fā)展方向是：（1）在現(xiàn)有的技術(shù)基礎(chǔ)上，尋找新的材料，設(shè)計(jì)新的酶固定方法，以此同時(shí)實(shí)現(xiàn)毛細(xì)管的再生利用，提高固定化酶的穩(wěn)定性； （2）設(shè)計(jì)毛細(xì)管電泳篩選酶抑制劑新的在線模式，以彌補(bǔ)上述在線模式的不足之處。隨著毛細(xì)管電泳技術(shù)的不斷發(fā)展完善，該技術(shù)應(yīng)用于酶抑制劑篩選的研究也會(huì)愈加成熟。endprint

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