流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)與質(zhì)量控制

劉敏　周曉明　張穎

【摘要】流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測HLA等位基因是最近新建立的方法，與原有的分型技術(shù)相比，技術(shù)上有很大的改進(jìn)和突破。流式細(xì)胞術(shù)已廣泛用于臨床常規(guī)檢驗中，為保證檢驗結(jié)果的可靠性，提高準(zhǔn)確度和室間結(jié)果的可比性，流式細(xì)胞術(shù)質(zhì)量控制越來越受到重視。它在功能水平上對單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選，同傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精密度高、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】流式細(xì)胞術(shù)；檢測技術(shù)；質(zhì)量控制

流式細(xì)胞儀檢驗技術(shù)（FCM），即流式細(xì)胞術(shù)，是以流式細(xì)胞儀作為檢測手段，以免疫熒光技術(shù)作為主要標(biāo)記方法的一門先進(jìn)的分析技術(shù)。該方法用免疫磁珠作為載體，在同一微孔內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，利用流式細(xì)胞儀檢測雜交信號和區(qū)分探針的種類。本技術(shù)使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用顏色進(jìn)行標(biāo)識[1]。當(dāng)免疫磁珠上兩種顏色混合的比例不同時，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測后即可區(qū)分定義為不同種類的免疫磁珠，目前兩種顏色的組合在流式細(xì)胞儀上最多可區(qū)分成為100種不同的免疫磁珠。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

收集近3年本院治療的30例患者，對30例患者行流式細(xì)胞儀檢測，30例受檢者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年齡60歲，最小年齡17歲，患者平均年齡39歲。

2 檢測方法

2.1 采用特定的免疫磁珠作為載體，將已知序列特異性探針（SSO）固定在免疫磁珠上，每一種特異性探針固定在已知顏色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上顏色比例的不同，在流式細(xì)胞儀紅色激光束下可進(jìn)行區(qū)分，根據(jù)事先設(shè)計的標(biāo)記情況，通過流式細(xì)胞儀檢測后可確認(rèn)特定顏色比例免疫磁珠上攜帶的特異性探針的種類，從而達(dá)到將探針區(qū)分的目的。

2.2利用標(biāo)記的特異性引物對目的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與免疫磁珠上的序列特異性探針（SSO）在同一孔內(nèi)進(jìn)行特異性雜交，再加入熒光顯色劑，然后利用流式細(xì)胞儀綠色激光束檢測雜交信號，紅色激光束區(qū)分探針的種類，利用軟件分析雜交結(jié)果得出樣本HLA基因型別。

3 方法學(xué)評價 該方法與PCR-SSO有相似的地方，但是技術(shù)上有重大的突破。本方法靈敏度非常高，在96孔微板上可進(jìn)行大規(guī)模的檢測，實現(xiàn)了所有探針的雜交于液相條件下在同一個孔內(nèi)進(jìn)行，而且采用免疫磁珠作為載體，具有快速、簡便、可靠的優(yōu)點(diǎn)，平均每個孔在流式細(xì)胞儀上檢測的時間不到30s。目前已有商品化的試劑供應(yīng)，同時該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于其他方面（如傳染病指標(biāo)等）的檢測和研究。

4 討論

流式細(xì)胞術(shù)常規(guī)測定由一系列繁瑣的步驟組成，大體可分為樣本采集和處理、免疫熒光染色、流式細(xì)胞儀檢測、數(shù)據(jù)分析及結(jié)果報告解釋，做好這些步驟中每一環(huán)節(jié)的工作可以確保室內(nèi)質(zhì)量控制（1Qc）和室間質(zhì)量控制（EQA）順利達(dá)標(biāo)。

標(biāo)本采集和制備，用于流式細(xì)胞分析的樣本種類很多，包括外周血、骨髓穿刺液、肺泡灌洗液、胸腹水、腦脊液及組織等，每種樣本都有不同的采集、保存、運(yùn)輸和制備要求。原則上標(biāo)本應(yīng)在采集后立刻進(jìn)行處理和熒光染色，尤其對檢測細(xì)胞活性的標(biāo)本，需要在采集后1小時內(nèi)染色測定。在某些特殊情況下不能及時進(jìn)行標(biāo)本制備和檢測而需要保存時，EDTA抗凝的標(biāo)本在室溫下可保存12～24小時，肝素抗凝通常在室溫下可保存至48～72小時，枸櫞酸抗凝在室溫下可保存至72小時，對于只作胞內(nèi)染色的樣本，根據(jù)待分析細(xì)胞的抗原特性和染色方式，可采用70%冷乙醇或1%多聚甲醛等固定細(xì)胞后保存數(shù)周。

流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)通常包括液路的穩(wěn)定性、光路的穩(wěn)定性、多色標(biāo)記熒光顏色補(bǔ)償、光電倍增管轉(zhuǎn)換的線性和穩(wěn)定性等[2]。儀器校準(zhǔn)品主要成分為聚苯乙烯，它被制成各種大小或同時擁有定量免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)的熒光微球，這種制成固定熒光強(qiáng)度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球，已成為流式細(xì)胞儀質(zhì)控中的一種常用的標(biāo)準(zhǔn)品。

精密度及其校準(zhǔn)微球精密度是通過對標(biāo)準(zhǔn)熒光微球檢測其散射光和熒光的分布范圍來描述的，通常以變異系數(shù)CV%來說明，CV%小于5可以滿足大多數(shù)實驗的要求。但細(xì)胞周期和倍體分析對儀器的精密度要求很高的，均質(zhì)性細(xì)胞間的變異必須小于2%。靈敏度及其校準(zhǔn)微球流式細(xì)胞儀的靈敏度可有多種表達(dá)方式，目前使用最為廣泛的方式是可溶性熒光染料等價分子數(shù)（MESF）法。該方法所用試劑盒由一系列標(biāo)記有MESF值的微球組成（包括未標(biāo)記熒光的空白微球），表明該微球所標(biāo)記熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度等同于溶液中熒光染料的分子數(shù)，根據(jù)微球檢測結(jié)果的平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行線性回歸分析，可得到流式細(xì)胞儀靈敏度的回歸曲線，回歸曲線與Y軸的交點(diǎn)即為該機(jī)的靈敏度，或叫做最低檢測限度[3]。準(zhǔn)確度及其校準(zhǔn)流式細(xì)胞儀的準(zhǔn)確度同精密度和靈敏度相比不很重要，但隨著定量流式細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展和熒光定量分析在實際工作中的需求越來越大，流式細(xì)胞儀準(zhǔn)確度的評價和質(zhì)控品也開始受到重視，在樣品中加入內(nèi)標(biāo)或某些生物活細(xì)胞，如雞或魚的紅細(xì)胞，可對儀器準(zhǔn)確度進(jìn)行有效監(jiān)測。當(dāng)使用兩種或以上的熒光素進(jìn)行分析時，激光激發(fā)下的相鄰或相近熒光素發(fā)出的熒光會產(chǎn)生交叉重疊，從而干擾檢測結(jié)果，通過調(diào)整熒光補(bǔ)償，可以保證每個檢測器檢測到恰當(dāng)?shù)膯我粺晒庑盘?，即保證了結(jié)果的可靠性。熒光補(bǔ)償是流式細(xì)胞術(shù)多色分析前必須進(jìn)行的儀器校準(zhǔn)，通常采用每種熒光素或相應(yīng)的標(biāo)記抗體對抗原表達(dá)量適中的細(xì)胞進(jìn)行單染色，來進(jìn)行儀器補(bǔ)償調(diào)整，也可以通過商品化熒光補(bǔ)償試劑進(jìn)行。當(dāng)使用各種標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)x器進(jìn)行校正時，需要將微球測定結(jié)果繪制成質(zhì)控圖，Levey-Jennings質(zhì)控圖是目前在臨床檢驗質(zhì)量控制中使用較多的方法，根據(jù)Levey-Jennings質(zhì)控圖的評價要點(diǎn)來觀察質(zhì)控結(jié)果是否超過控制限以決定失控與否。室間質(zhì)量評價主要是控制實驗室工作的不準(zhǔn)確度，自2000年以來，我國由衛(wèi)生部臨床檢驗中心開始組織開展臨床流式細(xì)胞術(shù)室間質(zhì)評工作，現(xiàn)已開展的項目包括T細(xì)胞亞群分析和CD34絕對計數(shù)。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 崔巍，牛福玲，何麗云，王碩仁.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的分析軟件比較.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報.2001.（6）45-47

[2] 陶德定；冷彥；覃吉超；余源；龔建平.新鮮腫瘤標(biāo)本活細(xì)胞與固定細(xì)胞的DNA含量分析比較.癌癥：英文版.200120（5）：502-504

[3] 曾文軍，王柳均，樊翌明，吳志華.細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)文選.2005.24（3）：425-426