大豆蛋白結(jié)構(gòu)表征方法的研究進(jìn)展*

曲玲玲，郭慶啟，石彥國(guó)，張 娜**

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)/黑龍江省普通高校食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076；2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040）

大豆蛋白是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源之一，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，且大豆蛋白的消化吸收率在84%～98%之間，可以直接作為人體蛋白質(zhì)的主要來源，更為重要的是大豆蛋白還具有與食品的嗜好性、加工性等相關(guān)的各種功能特性[1-2]。其良好的能性質(zhì)在改進(jìn)食品結(jié)構(gòu)、發(fā)展新食品方面有著重要意義。廣泛應(yīng)用于嬰幼兒食品、烘焙食品、肉制品、乳制品等行業(yè)之中，其重要性日趨明顯[3]。大豆蛋白因?yàn)樗牡鞍缀扛?，又可以改變食品的組織結(jié)構(gòu)和功能性，增加食品的營(yíng)養(yǎng)成分及物理性能，所以在許多食品中可替代昂貴的分離蛋白和乳蛋白。

大豆蛋白對(duì)食品的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味和加工性狀產(chǎn)生重大影響，這主要是因?yàn)榈鞍拙哂胁煌墓δ苄再|(zhì)。了解大豆蛋白的功能特性，有助于在食品加工業(yè)中正確使用大豆蛋白資源，也利于食品營(yíng)養(yǎng)成分的保持和利用，本文系統(tǒng)地介紹了大豆蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)功能性質(zhì)影響與結(jié)構(gòu)表征的方法，滿足人類對(duì)大豆蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的需求。

1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)功能特性的影響

大豆蛋白質(zhì)的功能特性主要指溶解性、乳化活性、吸油性、粘度和凝膠性，這些功能特性對(duì)食品加工十分重要。大豆蛋白具有復(fù)雜的初級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)，大豆蛋白的結(jié)構(gòu)特征決定大豆蛋白的功能特性。因此，凡是能夠改變蛋白結(jié)構(gòu)的因素，必將影響其功能特性[4]。

近年來，國(guó)內(nèi)外有許多學(xué)者通過改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來提高物質(zhì)本身的功能性質(zhì)。布冠好等[5]人對(duì)大豆蛋白－乳糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能特性進(jìn)行了研究。通過三硝基苯磺酸（TNBS）法、SDSPAGE電泳、紫外光掃描等方法研究蛋白結(jié)構(gòu)的變化。對(duì)不同時(shí)間下糖基化產(chǎn)物的功能特性結(jié)果表明，大豆蛋白的溶解性在36 h時(shí)改善效果最好，與純大豆分離蛋白相比，溶解性增加了大約30%；糖基化復(fù)合物的乳化性提高，乳化活性及乳化穩(wěn)定性分別在24、36 h達(dá)到最大。華欲飛[6]等研究了FSPC的乳化性能，結(jié)果表明：FSPC的乳化活性及乳化穩(wěn)定性與大豆分離蛋白相似，對(duì)固體脂肪的乳化能力超過分離蛋白，添加在乳化型碎肉制品中可使產(chǎn)品得率及質(zhì)構(gòu)超過添加分離蛋白的肉制品。Jeng-YuneLi[7]等對(duì)大豆?jié)饪s蛋白和玉米淀粉的合成物進(jìn)行了熱分析、流變分析和凝膠特性的分析。在二者形成的合成物中，大豆?jié)饪s蛋白減少了玉米淀粉的水分活度并增加了其吸熱溫度。張梅[8]等研究了功能性大豆?jié)饪s蛋白性能及其應(yīng)用，證實(shí)功能性大豆?jié)饪s蛋白的NSI值明顯提高，大豆蛋白功能特性有不同程度提高和改。研究還表明：經(jīng)物理方法改性的FSPC，有較好凝膠性、乳化性、持油和持水性。而經(jīng)酶法改性的FSPC有較好溶解性和乳化性。

2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表征方法

吸附于表面的蛋白質(zhì)存在各種不同取向，采用各種先進(jìn)儀器對(duì)與蛋白質(zhì)相互作用的表面進(jìn)行表征可大大幫助人們更為深入地了解蛋白質(zhì)和表面之間的相互作用，以及獲得界面蛋白質(zhì)有序度方面的信息[9]。

2.1 熱分析法

熱分析技術(shù)是研究物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)時(shí)依據(jù)溫度變化而進(jìn)行測(cè)量的一種動(dòng)態(tài)分析技術(shù)。熱分析技術(shù)的種類很多，有熱重法（TG），差熱分析法（DTA），差示掃描量熱法（DSC）等[10]。廣泛應(yīng)用于大豆蛋白研究的方法是差示掃描量熱法（DSC）。

近年來，DSC在大豆蛋白功能性質(zhì)研究中主要要涉及大豆蛋白11S和7S成分熱屬性及pH、離子強(qiáng)度、鈣離子、乙醇、2-巰基乙醇對(duì)大豆蛋白理化及功能性質(zhì)的影響，也涉及有關(guān)大豆蛋白水結(jié)合性能及其分散相流變性質(zhì)研究，Peturecclli等[11]人通過DSC法研究大豆分離蛋白熱穩(wěn)定性中pH誘導(dǎo)改性。實(shí)驗(yàn)表明未經(jīng)熱處理的大豆分離蛋白，pH增加導(dǎo)致疏水性增加。將pH 10～11和溫度約65℃時(shí)的熱處理相結(jié)合導(dǎo)致疏水基團(tuán)更多暴露，該條件下是最適合獲得具有較高乳化能力的大豆分離蛋白。Lakemond等[12]人對(duì)研究大豆球蛋白的比率影響熱變性的影響因素研究中。通過用DSC和CD（圓二色性）的結(jié)合研究表明，在pH 7.6時(shí)，大豆球蛋白主要以11S形式存在，在熱變性過程中，連接酸性和堿性亞基的二硫鍵斷裂。DSC研究發(fā)現(xiàn)酸性亞基進(jìn)一步裸露可能與較高的吸熱轉(zhuǎn)變溫度和放熱轉(zhuǎn)變的出現(xiàn)有關(guān)。大豆球蛋白的變性/聚集（DSC研究）和二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變（遠(yuǎn)紫外-CD研究）是同時(shí)發(fā)生的。

綜上，大豆蛋白的DSC法在研究食品蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和變性動(dòng)力學(xué)方面具有其不可替代的優(yōu)勢(shì)，在食品生產(chǎn)過程中調(diào)節(jié)大豆蛋白的功能屬性以利于其合理利用是非常重要的。此外，運(yùn)用熱分析法對(duì)于食品蛋白質(zhì)新資源的開發(fā)具有重要的意義，相信這些研究成果將有助于拓寬大豆蛋白在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用。

2.2 力學(xué)性能表征

質(zhì)構(gòu)和流變性是大豆蛋白力學(xué)性能表征的重要方法。質(zhì)構(gòu)是蛋白的一種有關(guān)脆、酥、硬、滑、粘等機(jī)械性感觀性質(zhì)，可從表觀上表征大豆蛋白的狀態(tài)，也可以從中了解蛋白質(zhì)及其組分的作用力。

Elena等[13]用質(zhì)構(gòu)分析儀（TPA）測(cè)定了大豆蛋白的質(zhì)構(gòu)特性，結(jié)果表明，對(duì)于11S蛋白，經(jīng)高溫再高壓處理的凝膠硬度比先高壓再高溫處理的凝膠硬度更高，蛋白質(zhì)分子中的化學(xué)鍵在預(yù)處理過程中被破壞，再形成的化學(xué)鍵對(duì)凝膠硬度有不同的影響。Puppo等[14]研究了大豆蛋白分散液和大豆蛋白乳化液的流變學(xué)行為，考察了熱致大豆蛋白凝膠的流變學(xué)參數(shù)，結(jié)果顯示大豆蛋白凝膠比其他醬類具有更高的彈性模量和粘稠度，且大豆蛋白這種結(jié)構(gòu)是由分子間的疏水作用所穩(wěn)定。

2.3 電泳法

十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）是大豆蛋白分析中比較常用的方法，可測(cè)定蛋白質(zhì)亞基分子量，研究不同分子量組分的情況。Yi JB[15]等人在研究由微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（MTGase）共價(jià)交聯(lián)大豆分離蛋白，對(duì)交聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行體外胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化，通過SDSPAGE電泳進(jìn)行分析（見圖1，泳道1）。

圖1 在37℃的不同時(shí)間下，大豆分離蛋白（SPI）的SDS-PAGE凝膠電泳圖

由圖1可以看出，SPI主要被分成大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白兩部分。當(dāng)培養(yǎng)與MTGase催化（20 U/g），在37℃，增加反應(yīng)時(shí)間從0～360min，大部分大豆蛋白質(zhì)成分的β-球蛋白和酸性亞基（AS）持續(xù)下降，并且相應(yīng)地，新的高分子生物聚合物逐漸增加，而大豆球蛋白的基本亞基（BS）的在整個(gè)期間幾乎沒有影響（見圖1，泳道2～8）。

Tang等[16]通過電泳還發(fā)現(xiàn)大豆球蛋白組分比β-伴大豆球蛋白組分更容易形成高分子量的生物聚合物，而且球蛋白的酸性亞基比β-伴大豆球蛋白的各組分更容易被MTGase聚合或交聯(lián)。SDSPAGE的定量研究中多采用光度掃描或凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行。

2.4 波譜法

通過各種波譜觀察大豆蛋白分子結(jié)構(gòu)構(gòu)象的變化，以深入地了解大豆蛋白結(jié)構(gòu)的變化，如紅外光譜、核磁共振和圓二色光譜等[17]。

2.4.1 傅里葉變換紅外光譜（ATR-FTIR） ATRFTIR是一種分析蛋白質(zhì)表面吸附取向與構(gòu)象的技術(shù)。ATR的應(yīng)用極大地簡(jiǎn)化了一些特殊樣品的測(cè)試，使微區(qū)成分的分析變得方便而快捷，檢測(cè)靈敏度可達(dá)10-9數(shù)量級(jí)，測(cè)量顯微區(qū)直徑達(dá)數(shù)微米[18]。

從紅外譜圖上酰胺鍵特征吸收峰的變化，可推蛋白分子的改性程度和交聯(lián)情況。黃友如等[19]人應(yīng)用FTIR研究了不同亞油酸濃度下脂肪氧合酶催化誘導(dǎo)產(chǎn)生的大豆蛋白聚集體的構(gòu)象變化。結(jié)果表明，在紅外光譜圖中，具有兩個(gè)較為明顯的特征，一是1 610 cm-1或1 615 cm-1附近譜峰分量的出現(xiàn)，二是酰胺I′各譜峰分量向低波數(shù)方向位移。當(dāng)大豆蛋白與脂肪氧合酶催化的亞油酸反應(yīng)時(shí)，通過氫鍵形成的分子間β-折疊結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和聚集體形成中發(fā)揮著重要的作用，并揭示了聚集蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化與大豆蛋白的聚集程度密切相關(guān)。

2.4.2 拉曼光譜（SERS） 拉曼光譜是一種能夠提供蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)信息的非破壞性的直接分析技術(shù)，相對(duì)傅里葉紅外轉(zhuǎn)換光譜和圓二色譜，拉曼光譜可以提供蛋白質(zhì)更為廣泛的結(jié)構(gòu)信息[20]。最早在1972年，Strekas和Spiro的工作揭開了拉曼光譜研究血紅蛋白結(jié)構(gòu)的新篇章。

近年來，有關(guān)利用拉曼光譜分析大豆蛋白構(gòu)型的研究國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道[18]。李迎秋[21]等人通過運(yùn)用激光拉曼光譜研究了脈沖電場(chǎng)對(duì)大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響。結(jié)果表明：大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是β-折疊和無規(guī)則卷曲。通過酰胺I帶和酰胺III帶拉曼特征峰的變化，說明脈沖處理使蛋白的β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增加，脈沖電場(chǎng)對(duì)巰基和二硫鍵有一定的影響。酪氨酸特征振動(dòng)頻率的變化說明脈沖電場(chǎng)破壞了維持蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵，使埋藏在疏水環(huán)境中的酪氨酸殘基暴露到分子的表面，更強(qiáng)的脈沖條件使暴露到蛋白表面的酪氨酸疏水基團(tuán)進(jìn)一步相互作用，形成疏水性強(qiáng)的基團(tuán)埋藏在分子內(nèi)部，從而導(dǎo)致蛋白功能性質(zhì)的改變。Wong[22]等人分析了酰胺化大豆分離蛋白和脫酰胺化的大豆分離蛋白的Ra?man光譜，研究其蛋白質(zhì)分子微觀結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)表示C-O伸縮振動(dòng)的1 780 cm-1波段強(qiáng)度與1 003 cm-1波段強(qiáng)度的比值隨著大豆分離蛋白脫酰胺作用程度的增加而增大。ZHAO[23]利用拉曼光譜分析添加乙酰基的大豆分離蛋白的酯化作用效果和結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)1 737 cm-1附近峰相對(duì)吸收強(qiáng)度與O-酯化作用程度成正比關(guān)系。

2.4.3 圓二色光譜（CD） 由于光學(xué)活性分子對(duì)左、右圓偏振光的吸收不同，使得左、右圓偏振光透過后變成橢圓偏振光，這種現(xiàn)象就是圓二色性（circular dichroism，CD）[24]。圓二色光譜既可用于大生物分子聚合物的空間構(gòu)型、構(gòu)象的靜態(tài)研究，也可用于當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，這些聚合物空間構(gòu)象的動(dòng)態(tài)變化過程。但是，CD技術(shù)不能直接提供蛋白質(zhì)分子和表面結(jié)合點(diǎn)的具體信息。Zhao J等[25]人對(duì)大豆蛋白水解物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行研究中，運(yùn)用CD技術(shù)計(jì)算出的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲的含量的變化，但結(jié)果與ATRFTIR的結(jié)果一致。

2.4.4 核磁共振 核磁共振（簡(jiǎn)稱NMR）是基于原子核磁性的一種波譜技術(shù)，是一種鑒定有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)和研究化學(xué)動(dòng)力學(xué)等的現(xiàn)代儀器分析方法[26]。NMR技術(shù)是能夠在原子分辨率下測(cè)定溶液中生物大分子三維結(jié)構(gòu)的唯一方法[27]。

利用核磁共振法能夠測(cè)定溶液中大豆蛋白改性中構(gòu)象的變化，還可研究蛋白分子的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)。Kakalis等[28]人運(yùn)用13C-NMR光譜研究提供有關(guān)7S大豆蛋白分子結(jié)構(gòu)和大豆蛋白加工如蛋白膠凝、蛋白改性和組織化新的而詳細(xì)的信息。田少君[29]等人對(duì)大豆分離蛋白的磷酸化改性進(jìn)行研究，通過核磁共振分析發(fā)現(xiàn)磷酸化反應(yīng)主要發(fā)生在大豆蛋白的賴氨酸和絲氨酸等含-NH2或-OH的殘基上。

2.4.5 X射線光電子能譜 X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）技術(shù)也被稱作用于化學(xué)分析的電子能譜（electron spectroscopy for chemicalanalysis，ESCA）。XPS不僅能夠給出材料表面的化學(xué)組成及含量，而且可以分析出化學(xué)價(jià)態(tài)、化學(xué)鍵等信息[30]。角分辨XPS可以在極薄的表層內(nèi)對(duì)化學(xué)信息進(jìn)行表征[31]，利用成像XPS技術(shù)，可以提供分析區(qū)域內(nèi)的元素及其化學(xué)狀態(tài)分布的信息圖像，并可由圖得譜。自德國(guó)物理學(xué)家倫琴1895年發(fā)現(xiàn)X射線以來，與其有關(guān)的分析技術(shù)不斷問世，X射線光電子能譜分析法就是其中的一種。

2.5 微觀結(jié)構(gòu)分析法

運(yùn)用電子掃描顯微鏡、原子力顯微鏡等可直接觀察蛋白質(zhì)的微觀表面形貌。

2.5.1 原子力顯微鏡（AFM） AFM（atomic force microscopy，AFM）能提供可靠的生物介質(zhì)表面單分子水平尺度形貌信息，并以其高分辨率，操作簡(jiǎn)單，制樣容易等特點(diǎn)而備受關(guān)注，若對(duì)小范圍的樣品表面的圖像進(jìn)行分析，還可以獲得物質(zhì)的晶形結(jié)構(gòu)、分子的結(jié)構(gòu)、聚集狀態(tài)、表面積及體積等方面的信息。

圖2 β-球蛋白及其亞基熱誘導(dǎo)聚集的AFM圖像

AFM允許動(dòng)態(tài)地研究蛋白質(zhì)在生命活動(dòng)不同時(shí)刻的狀態(tài)，在蛋白質(zhì)組裝動(dòng)力學(xué)研究中具有優(yōu)勢(shì)。AFM與蛋白質(zhì)單分子水平上研究蛋白質(zhì)識(shí)別也得到一定的發(fā)展。AFM將蛋白質(zhì)研究帶到了一個(gè)新的微觀層面，它已在蛋白質(zhì)成像、吸附、組裝、蛋白質(zhì)之間相互作用、蛋白質(zhì)與其他生物分子之間相互作用以及其他一些與蛋白質(zhì)有關(guān)的研究中得到了廣泛關(guān)注[32]。王昌盛[33]運(yùn)用AFM所觀察到的不同離子強(qiáng)度下的7S球蛋白80℃加熱不同時(shí)間后的原子力圖。結(jié)果表明，隨著7S球蛋白濃度的增大，使得“組裝單元”充足，使得7S球蛋白更容易發(fā)生自組裝纖維化反應(yīng)。

Yuan等[34]人運(yùn)用AFM研究大豆β球蛋白亞基的改進(jìn)提取方法見圖2所示。

如圖2所示，不同樣品形成的聚集體顯示出不同的形態(tài)模式。在樣品制備過程中，不溶性沉淀物通過離心去除，同時(shí)對(duì)聚集體進(jìn)行觀察，得到幾種不同的形態(tài)模式。圖a中β-伴大豆球蛋白的情況下更有序，并形成滯留聚集亞基。圖b中情況是相似的，β-伴大豆球蛋白較前者的聚集體情況更無序，成蠕蟲狀。圖c形成的聚集體的形態(tài)呈芽狀，雖然由于質(zhì)量不均勻使其制備過程中樣品分散，但還可以看得到。而在圖d的情況下，亞基沒有觀察到有序的聚集。

2.5.2 掃描電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscope，SEM）可以觀察蛋白質(zhì)微小顆粒的表面形貌，還可以與能譜儀配合進(jìn)行顆粒粒徑及數(shù)量的測(cè)量與統(tǒng)計(jì)，測(cè)試準(zhǔn)確度高，因而在大豆蛋白的分析領(lǐng)域具有不可替代的作用[35-36]。

段春紅等[37]人對(duì)大豆7S球蛋白堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，通過對(duì)粉體的SEM進(jìn)行觀察和分析。圖3為7S球蛋白及不同水解度的7S球蛋白堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的掃描電鏡圖。

從圖3可以看出，同未水解7S球蛋白相比較，酶解后樣品在相同的觀察條件下，其粉體結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變。未水解的7S球蛋白表面部分有輕微坑洼現(xiàn)象，隨著水解程度的增加，7S球蛋白酶解產(chǎn)物的表面結(jié)構(gòu)更為疏松。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明酶解改變了7S球蛋白的表面結(jié)構(gòu)。

2.5.3 掃描隧道顯微鏡 掃描隧道顯微鏡（Scanning Tunneling Microscopy，STM）與其他種類的顯微鏡相比，它的分辨本領(lǐng)卻可以達(dá)到10-10m。以量子力學(xué)為基礎(chǔ)的掃描隧道顯微鏡，可以在大氣、液體、真空狀態(tài)下工作，可以在4.2～1 000 K之間的溫度下工作；并且對(duì)樣品也無特殊要求，可以測(cè)量單晶、多晶、非晶等樣品表面；特別是掃描隧道顯微鏡可以與其他實(shí)驗(yàn)設(shè)備結(jié)合，應(yīng)用更加有效、靈活。因此，掃描隧道顯微鏡在物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、納米材料等領(lǐng)域中都得到了深入而廣泛的應(yīng)用，并取得了一系列重要的研究成果[38]。

圖3 不同水解度7S球蛋白掃描電鏡圖譜

3 小結(jié)和展望

大豆蛋白制品的功能特性及用途直接與產(chǎn)品加工工藝有關(guān)，不同工藝加工的產(chǎn)品有不同的功能特性。所以要致力于開發(fā)多品種、多功能、系列化的大豆蛋白產(chǎn)品，以充分體現(xiàn)功能性大豆蛋白的高營(yíng)養(yǎng)、高附加值。要加大基礎(chǔ)研究的力度，研究大豆蛋白提高各種功能特性的機(jī)理。剖析各種理化及生物因素對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能變化的影響，只有真正掌握這些變化規(guī)律，才能開發(fā)出更多更好的大豆蛋白產(chǎn)品，以應(yīng)用于更廣闊的市場(chǎng)領(lǐng)域。

近年來，對(duì)食品蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)的研究很多[39]，但是對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)聯(lián)系的了解比較少，人們對(duì)蛋白質(zhì)表征方面的研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展。由于計(jì)算機(jī)性能的快速發(fā)展，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展迅速。理論計(jì)算不僅提供了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)、電子結(jié)構(gòu)的信息如：能級(jí)、表面電荷分布、分子軌道相互作用等，而且還提供了蛋白質(zhì)與周圍環(huán)境（如水、離子和某些小分子）的相互作用。但是也還存在很多問題，還需要科學(xué)工作者更細(xì)致深入的分析和研究。

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