三倍體‘銀中楊’葉肉原生質(zhì)體制備的優(yōu)化

宋少宇，張俊琦，王 君＊

（1北京林業(yè)大學(xué) 林木育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，林木花卉遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083；2北京林業(yè)大學(xué) 公共分析測(cè)試中心，北京100083）

植物原生質(zhì)體是獲得細(xì)胞無(wú)性系和選育突變體的優(yōu)良起始材料，在植物快速繁殖、遠(yuǎn)緣遺傳重組、轉(zhuǎn)基因以及品種改良和創(chuàng)造新類(lèi)型等方面具有廣闊的應(yīng)用前景［1－2］。利用原生質(zhì)體可以進(jìn)行細(xì)胞融合和體細(xì)胞雜交，能有效克服植物有性雜交不親和現(xiàn)象，擴(kuò)大種、屬間的基因交流，豐富種質(zhì)遺傳資源，是一種創(chuàng)造遠(yuǎn)緣雜種，獲得同源或異源三倍體、四倍體以及雙二倍體的新途徑［3－4］；同時(shí)，原生質(zhì)體又是植物基因工程的理想受體，可為外源基因、DNA 片段、細(xì)胞器、染色體捕獲創(chuàng)造一種新方法［5］。

楊樹(shù)（PopulusL.）作為木本植物生物技術(shù)及遺傳學(xué)研究的模式樹(shù)種［6－7］，有關(guān)原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)已有一定的研究基礎(chǔ)。目前，國(guó)內(nèi)外相繼報(bào)道了毛白楊（P.tomentosa）、胡楊（P.euphratica）、美洲黑楊×歐美楊（P.deltoids×P.euramericana）、歐洲山楊×白楊（P.tremula×P.alba）等樹(shù)種原生質(zhì)體的成功游離，認(rèn)為酶的種類(lèi)與濃度、滲透壓、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH 值、不同材料和取材時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體的游離有顯著影響［8－11］。而且，已在毛白楊、北京楊（P.×beijingensis）、黑楊×大青楊（P.nigra×P.maximowiczii）等樹(shù)種中通過(guò)原生質(zhì)體培養(yǎng)獲 得 了 再 生 植 株［8，12－13］。然 而，這 些 研 究 均 以二倍體樹(shù)種作為材料，而作為楊樹(shù)育種的重要產(chǎn)品——三倍體品種，尚未見(jiàn)有關(guān)原生質(zhì)體游離和培養(yǎng)的報(bào)道。三倍體楊樹(shù)通常具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)能力和抗逆性，以三倍體原生質(zhì)體為材料開(kāi)展體細(xì)胞融合、基因工程及外源基因瞬時(shí)表達(dá)等研究對(duì)于楊樹(shù)遺傳改良及基因工程研究可能具有重要意義。

‘銀中楊’（P.alba×P.berolinensisYinzhong）是以銀白楊（P.alba）為母本，中東楊（P.berolinensis）為父本，經(jīng)人工遠(yuǎn)緣雜交選育而成的楊樹(shù)品種，屬白楊派與黑楊派派間雜種，并經(jīng)進(jìn)一步鑒定為三倍體品種［14］?！y中楊’樹(shù)干通直、形態(tài)優(yōu)美、可扦插繁殖、生長(zhǎng)迅速、材質(zhì)優(yōu)良，適宜作為民用建筑用材和造紙用材；同時(shí)，‘銀中楊’抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)范圍廣，且為雄性無(wú)性系，具有不飛絮的優(yōu)良特性。因此，‘銀中楊’既是營(yíng)造速生豐產(chǎn)林的優(yōu)良樹(shù)種，也是“三北”防護(hù)林、水源涵養(yǎng)林及北方寒冷地區(qū)城市綠化的優(yōu)秀樹(shù)種［15］。但‘銀中楊’扦插較難生根，成活率低，且苗期易受白楊透翅天蛾及青楊天牛的危害，給苗木繁育帶來(lái)困難［16－17］。本研究以‘銀中楊’無(wú)菌苗為試驗(yàn)材料，探索了葉肉原生質(zhì)體分離與純化條件，為通過(guò)細(xì)胞工程及基因工程育種等途徑開(kāi)展‘銀中楊’遺傳改良及品種優(yōu)化提供了新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材 料

于內(nèi)蒙古通遼市采集‘銀中楊’1年生枝條，塑料布包裹運(yùn)至北京林業(yè)大學(xué)，于溫室水培。無(wú)菌體系的建立和原生質(zhì)體分離試驗(yàn)在林木良種繁育技術(shù)研究室進(jìn)行。

1.2 原生質(zhì)體分離酶種類(lèi)及濃度篩選

本研究采用四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［L9（34）］篩選酶的種類(lèi)及濃度（表1），并采用單因素試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)Cellulase RS濃度進(jìn)行篩選（表4）。

剪取苗齡為25～30d的無(wú)菌苗第2～5片伸展葉片，將葉片切成寬0.5mm 左右的細(xì)條置于含0.7 mol／L甘露醇的CPW 鹽溶液（pH 5.8）中，于4 ℃黑暗條件下預(yù)質(zhì)壁分離1～1.5h。隨后將鮮重1g的葉片放入10mL經(jīng)過(guò)濾滅菌的混合酶液中，酶液為CPW 鹽溶液＋0.6g／L MES＋1g／L 牛血清蛋白＋0.6mol／L甘露醇，pH 5.8，28 ℃慢速往復(fù)式搖床（40～60r／min）上黑暗酶解7h。

每個(gè)處理重復(fù)3次，酶解產(chǎn)物依次經(jīng)200目和400目不銹鋼細(xì)胞篩過(guò)濾，以除去未酶解完全的細(xì)胞團(tuán)或組織，1 000r／min離心3min，用新鮮洗液洗滌3次收集原生質(zhì)體，稀釋到一定體積后統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體產(chǎn)量及活力。

1.3 原生質(zhì)體分離甘露醇濃度篩選

在由3.0% Cellulase RS＋0.5% Macerozyme R－10＋0.3%Pectinse Y－23組成的混合酶液中，分別添加0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mol／L甘露醇進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)，測(cè)定不同滲透壓下的原生質(zhì)體分離情況。

1.4 原生質(zhì)體分離酶解時(shí)間篩選

在由3.0% Cellulase RS＋0.5% Macerozyme R－10＋0.3%Pectinse Y－23＋0.6mol／L 甘露醇組成的混合酶液中，對(duì)‘銀中楊’葉片分別進(jìn)行2、4、6、8、10、12h黑暗酶解，測(cè)定不同酶解時(shí)間下原生質(zhì)體的分離情況。

1.5 原生質(zhì)體純化方法篩選

在CPW＋3.0% Cellulase RS＋0.5% Macerozyme R－10＋0.3%Pectinse Y－23＋0.6mol／L 甘露醇的混合酶液中，對(duì)‘銀中楊’葉片進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為8h。酶解完成后，酶解產(chǎn)物依次經(jīng)200目和400目不銹鋼細(xì)胞篩過(guò)濾，分別使用上浮法和下沉法對(duì)‘銀中楊’葉肉原生質(zhì)體進(jìn)行純化，測(cè)定不同純化方法下原生質(zhì)體的純化效果。

（1）上浮法。將濾液經(jīng)1 000r／min 離心3 min，收集沉淀并將之懸浮在蔗糖含量分別為30%、35%、40%、45%CPW＋0.6 mol／L 甘露醇溶液中。在其上緩緩加入適量CPW＋0.6 mol／L 甘露醇溶液，1 000r／min離心5min，在蔗糖－甘露醇界面上收集原生質(zhì)體。原生質(zhì)體用CPW＋0.6 mol／L 甘露醇溶液洗滌2次。

（2）下沉法。將濾液經(jīng)1 000r／min離心3min，收集沉淀并將之懸浮在CPW＋0.6mol／L甘露醇溶液中。在離心管中加入蔗糖含量分別為30%、35%、40%、45%CPW＋0.6mol／L甘露醇溶液，將原生質(zhì)體混合液緩緩鋪于其上方，1 000r／min離心5min，在蔗糖－甘露醇界面上收集原生質(zhì)體。原生質(zhì)體用CPW＋0.6mol／L甘露醇溶液洗滌2次。

1.6 原生質(zhì)體的產(chǎn)量與活力測(cè)定

用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體產(chǎn)量，每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)5次，取平均值，最后計(jì)算原生質(zhì)體產(chǎn)量。

原生質(zhì)體數(shù)（個(gè)／mL）＝5個(gè)大格內(nèi)原生質(zhì)體總數(shù)×5×10 000×稀釋倍數(shù)；

原生質(zhì)體產(chǎn)量（個(gè)／g）＝［原生質(zhì)體數(shù)（個(gè)／mL）×稀釋后體積（mL）］／葉片總質(zhì)量（g）；

對(duì)獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行開(kāi)平方根轉(zhuǎn)換后，用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

用0.01%二乙酸熒光素（FDA）染色進(jìn)行原生質(zhì)體活力測(cè)定，每個(gè)樣品觀(guān)測(cè)5次，取平均值。

原生質(zhì)體活力＝（發(fā)綠色熒光的原生質(zhì)體數(shù)÷原生質(zhì)體總數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶濃度組合對(duì)原生質(zhì)體分離的影響

本試驗(yàn)采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)‘銀中楊’原生質(zhì)體分離所需的酶種及最佳處理濃度進(jìn)行篩選。由極差分析（表1）可知，Cellulase RS的R值最大為572.98，表明Cellulase RS對(duì)‘銀中楊’原生質(zhì)體分離的影響最大；Hemicellulase的R值最小為164.93，表明其影響最小。各因素對(duì)‘銀中楊’原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響順序?yàn)椋篊ellulase RS＞Pectinse Y－23＞Macerozyme R－10＞Hemicellulase。本試驗(yàn)中第7個(gè)處理組合原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，最接近最優(yōu)組合。

方差分析（表2）發(fā)現(xiàn)，Macerozyme R－10 和Hemicellulase各個(gè)水平間差異不顯著，應(yīng)選擇最低濃度，而Cellulase RS和Pectinse Y－23各個(gè)水平間差異極顯著。采用最小顯著差數(shù)法（LSD）對(duì)Cellulase RS 和Pectinse Y－23 各個(gè)水平進(jìn)行多重比較（表3），Cellulase RS第3水平最好，與第1、2水平差異極顯著。由于最好的結(jié)果出現(xiàn)在Cellulase RS最高水平上，不能肯定是否為最佳處理濃度，因此需要通過(guò)單因素試驗(yàn)進(jìn)一步篩選其最佳處理濃度（表4）。Pectinse Y－23第2水平處理效果最好，且與第1、3水平差異極顯著，水平2、3間差異不顯著，因此Pectinse Y－23最佳處理濃度為第2水平，即0.3%。

表1 不同酶種類(lèi)及其濃度處理‘銀中楊’葉肉原生質(zhì)體產(chǎn)量及分析Table1 Range analysis of enzyme solution for Populus alba×P.berolinensis Yinzhong mesophyll protoplast yields

表2 方差分析表Table2 Analysis of variation

Cellulase RS單因素試驗(yàn)（表4）結(jié)果表明，Cellulase RS的各處理間原生質(zhì)體產(chǎn)量差異極顯著，Cellulase RS濃度為第1 水平（3.0%）時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量極顯著性高于其他處理，第2、3水平之間原生質(zhì)體產(chǎn)量差異不顯著，且隨著Cellulase RS濃度的升高原生質(zhì)體產(chǎn)量下降，而原生質(zhì)體活力差異不顯著。因此，‘銀中楊’葉片原生質(zhì)體分離最佳酶濃度組合為3%Cellulase RS＋0.5% Macerozyme R－10＋0.3%Pectolase Y－23。

2.2 不同甘露醇濃度對(duì)原生質(zhì)體分離的影響

在各種酶濃度一定的條件下，使用不同濃度甘露醇調(diào)節(jié)滲透壓。結(jié)果（圖1）表明，甘露醇濃度對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力有極顯著性影響。當(dāng)甘露醇濃度在0.4～0.6mol／L范圍內(nèi)逐漸升高時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力也隨之升高；當(dāng)甘露醇濃度達(dá)到0.6 mol／L時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力均達(dá)到最高值，且顯著性高于其他處理，分別為1.84×107個(gè)／g 和83.28%（圖3，A、C）；當(dāng)甘露醇濃度為0.6～0.8 mol／L 時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力都隨著甘露醇濃度的升高而降低。因此，‘銀中楊’原生質(zhì)體游離最佳甘露醇濃度為0.6mol／L。

表3 Cellulase RS和Pectinse Y－23各個(gè)水平之間的多重比較Table3 Multiple comparisons among levels of Cellulase RS and Pectinase Y－23

表4 Cellulase RS處理濃度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響Table4 Effects of Cellulase RS on protoplast yields and viability

2.3 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體分離的影響

在酶濃度和滲透壓一定的條件下，設(shè)置酶解時(shí)間分別為2、4、6、8、10、12h。結(jié)果（圖2）表明，酶解時(shí)間對(duì)‘銀中楊’原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力有極顯著性影響。隨著酶解時(shí)間的增長(zhǎng)，原生質(zhì)體產(chǎn)量會(huì)有所提高，但原生質(zhì)體的活力逐步降低（圖2）。酶解時(shí)間為2～8h時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著酶解時(shí)間的增長(zhǎng)而逐漸增加，且在酶解8h時(shí)達(dá)到最高；酶解時(shí)間超過(guò)8h后，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著酶解時(shí)間的增長(zhǎng)而減少，在12h時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量高于10h但差異不顯著，這可能是由試驗(yàn)誤差等因素引起的；當(dāng)酶解時(shí)間為8h時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量極顯著性高于其他酶解時(shí)間，達(dá)2.13×107個(gè)／g。原生質(zhì)體的活力隨酶解時(shí)間的增長(zhǎng)而逐漸降低，酶解時(shí)間為4～8 h時(shí)，原生質(zhì)體活力差異不顯著；酶解時(shí)間為10～12h時(shí)原生質(zhì)體活力降低的幅度加大，且極顯著性低于酶解時(shí)間為8h時(shí)的原生質(zhì)體活力。因此，‘銀中楊’葉肉原生質(zhì)體最佳游離時(shí)間為8h。

圖1 甘露醇濃度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響Fig.1 Effects of mannitol concentration on protoplast yield and viability

圖2 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體分離的影響Fig.2 Effects of enzymolytic time on protoplast isolation

圖3 ‘銀中楊’葉肉原生質(zhì)體分離與純化Fig.3 Isolation and purification of mesophyll protoplasts of P.alba×P.berolinensis Yinzhong

2.4 蔗糖濃度和純化方法對(duì)原生質(zhì)體純化的影響

酶解完成后分別采用不同濃度的蔗糖對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行等密度離心純化，并對(duì)比上浮法和下沉法的純化效果（表5）。由表5可知，上浮法的純化效果明顯優(yōu)于下沉法。隨著蔗糖濃度的增加，純化后原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸增加，到45%時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最大，但雜質(zhì)含量也達(dá)到最大；而蔗糖濃度為40%時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量也很高，為1.06×107個(gè)／g，且雜質(zhì)含量較低，為19.05%。因此，采用上浮法用40%蔗糖，在1000r／min下離心5min，原生質(zhì)體產(chǎn)量較高，雜質(zhì)含量較少，純化效果較好（圖3，B）。

3 討 論

原生質(zhì)體分離時(shí)，材料本身的性質(zhì)和生理狀態(tài)對(duì)原生質(zhì)體分離甚至培養(yǎng)有著重要影響［18］，組織培養(yǎng)的無(wú)菌苗生長(zhǎng)整齊，生理狀態(tài)比較一致，成苗期短，經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)，可保持樹(shù)木的幼態(tài)特征，是分離原生質(zhì)體比較理想的材料，能提高試驗(yàn)的重復(fù)性［19］。Park和Son從黑楊×大青楊雜種葉片分離獲得大量有活力的原生質(zhì)體，產(chǎn)量為1.04×107個(gè)／g［13］；而蔡肖和康向陽(yáng)以小青楊無(wú)菌苗葉片為材料，游離原生質(zhì)體的產(chǎn)量達(dá)到2.44×107個(gè)／g［20］?？梢?jiàn)，不同樹(shù)種葉肉原生質(zhì)體分離效果有所差異，這可能與其葉片結(jié)構(gòu)及細(xì)胞壁組成有關(guān)。本研究采用‘銀中楊’培養(yǎng)約30d的無(wú)菌苗葉片分離原生質(zhì)體，原生質(zhì)體活力為80.18%，產(chǎn)量為2.13×107個(gè)／g，可以滿(mǎn)足進(jìn)一步進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)的要求。

表5 蔗糖濃度及純化方法對(duì)原生質(zhì)體純化效果的影響Table5 Effects of different sucrose concentration and purification methods on protoplast purification

影響原生質(zhì)體分離效果的因素有很多，酶的種類(lèi)與濃度影響最大。Conde和Santos對(duì)比了Cellulase RS 和Cellulase R－10 對(duì)小葉榆（UlmusminorMill.）葉肉原生質(zhì)體分離的影響，發(fā)現(xiàn)Cellulase RS分離效率更高［19］。景艷春等進(jìn)行新疆楊（P.albaL.var.pyramidalis）葉肉原生質(zhì)體游離時(shí)酶液中添加了0.5% Hemicellulase，產(chǎn)量可達(dá)1.57×107個(gè)／g［21］，而本研究中‘銀中楊’葉肉原生質(zhì)體分離在未添加Hemicellulase情況下，產(chǎn)量遠(yuǎn)高于前者，達(dá)2.13×107個(gè)／g。可見(jiàn)，不同酶種類(lèi)對(duì)原生質(zhì)體分離效果影響不同，不同樹(shù)種原生質(zhì)體分離所需要的酶種類(lèi)及濃度也有所差異，這可能與其細(xì)胞壁組成成分有關(guān)。本研究通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和單因素簡(jiǎn)單試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出最佳酶組合為3%Cellulase RS＋0.5% Macerozyme R－10＋0.3%Pectinse Y－23。

為保持原生質(zhì)體膜穩(wěn)定性，常常在酶液中加入甘露醇作為滲透壓調(diào)節(jié)劑。不同植物原生質(zhì)體分離時(shí)采用的甘露醇濃度也有所差異，一般濃度為0.3～0.8mol／L。擬南芥（Arabidopsisthaliana）葉肉原生質(zhì)體分離時(shí)甘露醇濃度為0.4mol／L［22］，王善平等在分離毛白楊原生質(zhì)時(shí)甘露醇濃度則為0.5 mol／L［8］。而本研究中‘銀中楊’葉肉原生質(zhì)體分離適宜的甘露醇濃度為0.6mol／L，與王善平所采用的甘露醇濃度有所不同，這可能是由于不同植物細(xì)胞質(zhì)濃度有所差異。

酶解時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)于獲得原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力影響很大。酶解時(shí)間短，則酶解不夠充分，原生質(zhì)體產(chǎn)量低；酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)原生質(zhì)體有毒害作用，導(dǎo)致原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力降低［23］。百合（Lilium ledebouriiBioss.）葉片原生質(zhì)體分離需要24h［23］，毛白楊葉肉原生質(zhì)體分離需要12～14h［8］，而本研究中‘銀中楊’葉肉原生質(zhì)體分離最佳酶解時(shí)間則為8h?？梢?jiàn)，不同植物和材料對(duì)酶解時(shí)間的需求有所差異。酶解時(shí)間可能與起始材料、酶的種類(lèi)和濃度等因素有關(guān)，應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行探索。另外，在本研究中酶解12h原生質(zhì)體產(chǎn)量高于酶解10h，但差異不顯著，在他人的研究結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)類(lèi)似情況，這可能是由試驗(yàn)誤差等因素引起的數(shù)據(jù)小幅度波動(dòng)。

原生質(zhì)體純化方法是影響原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的重要因素之一。景艷春等進(jìn)行新疆楊原生質(zhì)體純化時(shí)，采用上浮法蔗糖濃度為30%時(shí)純化效果最好［21］。然而，在‘銀中楊’葉肉原生質(zhì)體純化時(shí)，上浮法蔗糖濃度為40%時(shí)，純化效果最好，產(chǎn)量達(dá)1.06×107個(gè)／g?？梢?jiàn)，不同樹(shù)種原生質(zhì)體純化方法有所不同，這可能是因?yàn)槠浼?xì)胞大小、密度等有所差異，純化過(guò)程中細(xì)胞所受的離心力不同。

許多楊樹(shù)品種都是三倍體，楊樹(shù)三倍體生殖能力降低，材積的增益更大，在速生性、材質(zhì)、抗逆性以及對(duì)病蟲(chóng)害的防御能力方面具有明顯優(yōu)勢(shì)［24］。原生質(zhì)體是理想的基因工程受體，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)三倍體進(jìn)行遺傳改良有可能極大地提高抗性和木材品質(zhì)等。三倍體原生質(zhì)體的獲得有利于通過(guò)功能基因瞬時(shí)表達(dá)分析進(jìn)行多倍體數(shù)量性狀表達(dá)相關(guān)研究，以及三倍體細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路等研究。同時(shí)，三倍體與二倍體或三倍體細(xì)胞進(jìn)行融合可獲得五、六倍體雜種，為育種工作提供遺傳材料。加強(qiáng)對(duì)三倍體楊樹(shù)的細(xì)胞工程及基因工程育種技術(shù)研究，可以為育種工作提供新的途徑和遺傳材料，具有重要意義。

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