混合鹽堿脅迫下叢枝菌根真菌對紫花苜蓿生長及2種酚酸含量的影響

趙 琦，包玉英

（內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010021）

內(nèi)蒙古自治區(qū)的鹽堿地主要是由地理位置和人為不合理灌溉形成的［1］。隨著耕地鹽漬化面積的逐年遞增，農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)已經(jīng)受到嚴重影響。因此，培養(yǎng)耐鹽堿的作物新品種是利用和改良鹽堿土壤的一種有效措施［2］。紫花苜蓿是一種多年生豆科牧草植物，在鹽堿地中具有較強的耐寒、耐鹽堿特性和明顯的高產(chǎn)優(yōu)勢［3］，且紫花苜蓿若干品種已經(jīng)在內(nèi)蒙古鹽堿地區(qū)進行相關(guān)的引種試驗［4］。內(nèi)蒙古地區(qū)的鹽堿土壤環(huán)境中叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）資 源 豐 富［5］，一 方 面 鹽 堿 生 境 對AMF的多樣性與生理生態(tài)功能產(chǎn)生直接影響［6］，另一方面AMF 與植物的根系共生形成菌根，能夠顯著改善植物養(yǎng)分和水分的吸收，影響植物的生理代謝過程，增強植物的抗逆性［7］。摩西球囊霉是一類對環(huán)境適應(yīng)能力強、應(yīng)用范圍廣的叢枝菌根真菌，并對紫花苜蓿作用時間最早、作用效果最佳，比其余種類的AMF 更能顯著地促進紫花苜蓿的生長發(fā)育［8］。

近幾年研究發(fā)現(xiàn)，鹽堿脅迫對紫花苜蓿的生長［9］、組織結(jié)構(gòu)［10］、根系發(fā)育［11］、種子萌發(fā)［12］、遺傳多 樣性［13］、光 合 作 用［14－15］與 抗 氧 化［16］等 特 性 均 產(chǎn)生影響，且在單鹽脅迫條件下接種AMF 能夠調(diào)節(jié)紫花苜蓿的生理生長來增加植物的耐鹽適應(yīng)性［17－18］。酚酸類物質(zhì)是植物生長過程中所產(chǎn)生的一類重要次生代謝產(chǎn)物，其可以通過增加植物細胞壁厚度［19］以及調(diào)控抗氧化酶活性來增加植物的抗逆能 力［20－22］，有研 究 表 明 接 種AMF 能 夠 促 進 宿 主 植物體內(nèi)酚酸含量的積累［23］。但是，在混合鹽堿脅迫條件下，接種摩西球囊霉對紫花苜蓿生長以及體內(nèi)酚酸含量的影響卻鮮有報道。因此，本試驗以摩西球囊霉為接種菌劑，通過盆栽實驗，研究在混合鹽堿脅迫下，接種AMF 處理對紫花苜蓿生長的影響以及與植物體內(nèi)酚酸含量的關(guān)系。為充分利用AMF資源提高紫花苜蓿品質(zhì)、改良鹽堿地等提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 供試材料

供試植物為“中苜一號”紫花苜蓿（Medicago sativa L．），種子由山東新泰周全農(nóng)業(yè)科技有限公司提供；供試菌種為摩西球囊霉（Glomus mosseae），由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所提供；培養(yǎng)基質(zhì)為蛭石和河沙混合而成，在121 ℃、141 kPa下滅菌2h，取出晾涼后，再重復(fù)1次，以確?；|(zhì)中不含任何土著AMF。

1．2 材料培養(yǎng)與處理

（1）混合鹽堿脅迫處理：以蒸餾水（CK，pH 為7．03）作對比，將NaCl、Na2SO4、Na2CO3、NaHCO3按不同摩爾比混合［24］模擬出4 種鹽濃度（25、75、100、150mmol·L－1；鹽脅迫）、16種pH 梯度（pH 8．39～10．90；堿脅迫），共17個處理（表1）。（2）接種處理：分為接種AMF（采用層播法，每盆接種5g菌劑）處理與不接菌（每盆施5g滅菌接種物，以保持微生物區(qū)系一致性）處理。試驗設(shè)計共34個處理組合，每個處理組合重復(fù)3 次，共102個盆缽，隨機排列。

表1 各處理液的鹽分組成、鹽濃度、摩爾比及pH 值Table 1 Salt composition，salt concentration，molar ratio and pH of solutions in mixed salt treatments

用白色塑料花盆（12cm×13cm×15cm，70%酒精浸泡1h，自來水沖洗干凈，晾干）裝混有10g蛭石的沙土1．5kg，每盆播種30 粒紫花苜蓿種子（1%NaClO 消毒10min），7d 后間苗至每盆20株。在溫室內(nèi)培養(yǎng)35d后，開始對紫花苜蓿進行鹽堿脅迫處理，按表1分別透灌相應(yīng)處理溶液100mL，2d 1次，共澆5次（共10d）。再穩(wěn)定培養(yǎng)4d后，進行存活率、株高、總生物量的測量；取紫花苜蓿的葉片進行可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸含量的測定；取紫花苜蓿的地上部分進行阿魏酸、水楊酸含量的測定。

1．3 測定指標(biāo)及方法

幼苗存活率用計數(shù)法測定；株高用直尺測量；總生物量用稱重法測定；可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍G－250 染色法測定；游離脯氨酸含量采用磺基水楊酸法測定［25］；阿魏酸、水楊酸含量利用葉日貴等［26］方法測定。其中，阿魏酸、水楊酸含量的測定先根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再據(jù)此測定樣品的含量。過程如下：先將阿魏酸、水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品儲液分別用DMSO 按1∶4∶4∶4∶4比例梯度稀釋，制得5份標(biāo)準(zhǔn)品使用液；再對標(biāo)準(zhǔn)品使用液檢測結(jié)果進行分析，以待測物的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進行線性回歸，獲得線性方程（表2）。

表2 各標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系Table 2 Linear relationships of standard sample

1．4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS V 21．0和Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 AMF 對混合鹽堿脅迫下紫花苜蓿幼苗生長的影響

2．1．1 存活率 幼苗存活率是植物耐鹽堿能力的綜合指標(biāo)之一。圖1所示，在鹽濃度0～150mmol·L－1、pH 值7．03～8．48條件下（A 比例組），接種AMF和未接菌紫花苜蓿幼苗存活率均為100%；在鹽濃度為0～25mmol·L－1下，B、C、D 比例組的接菌和未接菌苜蓿幼苗的存活率也均為100%，在鹽濃度大于25mmol·L－1開始出現(xiàn)死亡。即在混合鹽堿脅迫條件下，紫花苜蓿幼苗的存活率受堿脅迫（pH 值）的影響比鹽脅迫更敏感。隨著鹽堿梯度的不斷增加，高鹽濃度（≥75mmol·L－1）與高pH 值（≥9．19）的協(xié)同作用導(dǎo)致紫花苜蓿的存活率明顯降低，在鹽濃度大于75mmol·L－1下，B、C、D 比例組接菌處理比未接菌處理幼苗的存活率高，如它們接菌處理的存活率在鹽濃度為150mmol·L－1時，分別比未接菌處理顯著提高了59．5%、60．6%和28．8%（P＜0．05）。從整體上分析，紫花苜蓿幼苗的存活率在接菌處理下顯著高于未接種處理（P＜0．05），且在鹽脅迫、堿脅迫、鹽堿脅迫以及接種AMF處理下均受到顯著影響（P＜0．001），同時受到AMF與堿脅迫、鹽脅迫、鹽堿脅迫的交互作用顯著影響（P＜0．001），說明接種AMF 提高了鹽堿混合脅迫下紫花苜蓿幼苗的存活率。

2．1．2 株高 圖1顯示，非鹽堿條件（CK）下，接菌處理組紫花苜蓿幼苗的株高比未接菌處理組顯著高20%（P＜0．001）；鹽堿條件下，接種AMF處理組與未接菌處理組的株高均隨著鹽堿梯度的增加而顯著下降且表現(xiàn)為A＞B＞C＞D，即鹽堿脅迫抑制了紫花苜蓿的株高；除D25接菌處理組比相應(yīng)未接菌處理組提高了41．8%且差異不顯著（P＞0．05）外，其余A、B、C、D 各個處理組的株高在接菌處理下均比相應(yīng)未接菌處理提高且差異顯著（P＜0．05）。整體上分析，紫花苜蓿幼苗株高在接菌處理下顯著高于未接菌處理（P＜0．001），并且受到鹽堿脅迫、堿脅迫、鹽脅迫與接種AMF 處理的顯著影響（P ＜0．01），也受到AMF 與堿脅迫、鹽堿脅迫的交互作用顯著影響（P＜0．01）；但AMF與鹽脅迫的交互作用對紫花苜蓿的株高影響不顯著（P＞0．05）。說明混合鹽堿條件下，接種AMF 對堿脅迫條件下紫花苜蓿株高的影響比鹽脅迫條件下更為顯著，但總體上接種AMF 緩解了鹽堿脅迫的抑制作用，顯著增加了鹽堿脅迫下紫花苜蓿的株高。

2．1．3 總生物量 從圖1可知，非鹽堿條件（CK）下，接菌處理的紫花苜蓿幼苗總生物量比未接菌的顯著高130%（P＜0．001）；在鹽堿脅迫條件下，接種AMF處理組和未接菌處理組的紫花苜蓿總生物量隨著鹽堿梯度的增加而下降，且表現(xiàn)為A＞B＞C＞D，即鹽堿脅迫抑制了紫花苜蓿的生長；除接菌處理組D75的總生物量比相應(yīng)未接菌組提高了7．1%但差異不顯著（P＜0．05）外，其余A、B、C、D 各個處理組的總生物量接菌的比相應(yīng)未接菌的均顯著提高。整體上分析，紫花苜蓿幼苗總生物量表現(xiàn)為接菌處理組顯著高于未接菌處理組（P＜0．001），并受到鹽脅迫、堿脅迫、鹽堿脅迫與接種AMF的顯著影響（P＜0．001），也同時受到AMF與鹽脅迫、鹽堿脅迫的交互作用的顯著影響（P＜0．01）；但是，AMF 與堿脅迫的交互作用對紫花苜蓿的總生物量影響差異不顯著（P＞0．05）。說明接種AMF 對紫花苜?？偵锪坑绊?，在鹽脅迫條件下比混合鹽堿條件下表現(xiàn)得更為明顯；但總體上接種AMF 能夠維持植物的正常生長，從而增加紫花苜蓿的總生物量。

2．2 AMF對紫花苜蓿脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響

2．2．1 脯氨酸含量 植物體內(nèi)脯氨酸含量一定程度上反映植物的抗逆性，積累的脯氨酸含量多說明抗逆能力強，因此脯氨酸含量可以作為植物抗逆的生理指標(biāo)。從圖2所示，非鹽堿條件（CK）下，接菌處理紫花苜蓿幼苗的脯氨酸含量比未接菌處理顯著高3%（P＜0．05）；在鹽堿脅迫條件下，接種AMF處理組和未接菌處理組的紫花苜蓿中脯氨酸含量隨著鹽堿梯度的增加而增加，且表現(xiàn)為D＞C＞B＞A，即在鹽堿脅迫的協(xié)同作用下導(dǎo)致脯氨酸的大量積累，與堿脅迫相比，鹽脅迫下的脯氨酸含量的增長率更高（與其它鹽濃度相比，鹽濃度150 mmol·L－1時，脯氨酸含量最高）；此外，接菌處理組的脯氨酸含量比相應(yīng)未接菌組顯著提高（P＜0．05），在150 mmol·L－1，pH 值10．9條件下，D150接菌處理組的比相應(yīng)未接菌組的脯氨酸含量顯著提高211%（P＜0．001）。整體上分析，紫花苜蓿幼苗的脯氨酸含量表現(xiàn)為接菌處理組顯著高于未接菌處理組（P＜0．01），且受到堿脅迫、鹽脅迫、鹽堿脅迫與接種AMF的顯著影響（P＜0．001），也同時受到AMF與堿脅迫、鹽脅迫、鹽堿脅迫之間的交互作用的顯著影響（P＜0．001）。表明接種AMF能顯著提高紫花苜蓿中脯氨酸的含量，從而增加寄主植物的滲透調(diào)節(jié)能力，增強植物的抗鹽堿性。

圖1 混合鹽堿脅迫對紫花苜蓿存活率、株高和總生物量的影響“M＋”和“M－”分別表示植物接種和未接種摩西球囊霉；不同小寫字母表示相同接種條件下處理間在0．05水平存在顯著性差異；下同F(xiàn)ig．1 Effects of various salt－alkaline mixed stress conditions on the survival rate，height and total biomass of alfalfa“M＋”and“M－”shows that plants were inoculated and not inoculated with G．mossese，respectively；Different lowercase letters within same inoculation indicate significantly different among treatments at 0．05level；The same as below．

圖2 混合鹽堿脅迫對紫花苜蓿脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響Fig．2 Effects of various salt－alkaline mixed stress conditions on the proline and soluble protein contents of alfalfa

2．2．2 可溶性蛋白質(zhì)含量 從圖2可知，非鹽堿條件（CK）下，接菌處理的紫花苜蓿幼苗的可溶性蛋白質(zhì)含量比未接菌處理顯著高9．2%（P ＜0．001）；鹽堿條件下，接種AMF處理組和未接菌處理組的紫花苜蓿的可溶性蛋白質(zhì)含量隨著鹽堿梯度的增加而降低，且表現(xiàn)為A＞B＞C＞D，即鹽堿脅迫促進了紫花苜蓿中可溶性蛋白質(zhì)的分解；在pH 值≥9．18條件下，未接菌處理組顯著降低，而在pH值≥10．23條件下，接菌處理組才出現(xiàn)顯著降低，說明接種AMF降低了可溶性蛋白質(zhì)對堿脅迫的敏感度；在鹽濃度為25mmol·L－1條件下，D 比例組接菌比未接菌的幼苗高9．5%但差異不顯著（P＞0．05），A、B、C 比例組接菌比相應(yīng)未接菌的幼苗顯著提高（P＜0．001）；在鹽濃度為100 mmol·L－1時，C比例組接菌比相應(yīng)未接菌的幼苗高25．9%（P＜0．001），A、B、D 比例組接菌比未接菌的幼苗高但差異不顯著（P＞0．05）。整體上分析，紫花苜蓿幼苗的可溶性蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)為接菌處理組顯著高于未接菌處理組（P＜0．001），且受到鹽脅迫、堿脅迫、鹽堿脅迫以及接種AMF 的顯著影響（P＜0．001）；同時受到AMF 與堿脅迫（P＜0．01）、鹽堿脅迫（P＜0．001）之間的交互作用的顯著影響；但是，AMF與鹽脅迫之間的交互作用對紫花苜蓿可溶性蛋白質(zhì)含量影響差異不顯著（P＞0．05）。說明混合鹽堿條件下，接種AMF 對紫花苜?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量的作用，堿脅迫更為顯著，接種AMF增加了可溶性蛋白質(zhì)在鹽堿脅迫下的穩(wěn)定性。

2．3 AMF 對紫花苜蓿酚酸含量的影響

2．3．1 水楊酸含量 從圖3 所示，非鹽堿條件（CK）下，未接種AMF的紫花苜蓿幼苗的水楊酸含量比接菌處理的顯著高623．9%（P＜0．05）；鹽堿條件下，接菌處理組和未接菌處理組的水楊酸含量隨著鹽堿梯度的增加而增加，且表現(xiàn)為D＞C＞B＞A，即植物通過水楊酸的積累來調(diào)節(jié)自身的抗鹽堿性；未接菌處理組C25比相應(yīng)接菌處理組的水楊酸含量顯著高107．3%（P＜0．05），其余各個處理組未接菌比相應(yīng)接菌的水楊酸含量高（P＜0．01）。整體上分析，紫花苜蓿幼苗的水楊酸含量表現(xiàn)為未接菌處理組顯著高于接菌處理組（P＜0．01），且受到鹽脅迫、堿脅迫、鹽堿脅迫與接種AMF 的顯著影響（P＜0．001）；也同時受到AMF 與鹽脅迫、堿脅迫、鹽堿脅迫之間的交互作用的顯著影響（P＜0．001）；說明紫花苜蓿通過提高水楊酸含量來調(diào)節(jié)植物的抗鹽堿性的反應(yīng)接種AMF 比未接菌的弱。而且，無論是否在鹽堿條件下，水楊酸可能既參與了對紫花苜?？果}堿性的調(diào)節(jié)作用，又參與了紫花苜蓿的防御系統(tǒng)抑制AMF 侵染，導(dǎo)致接菌處理組比未接菌處理組紫花苜蓿中水楊酸的含量低。

圖3 混合鹽堿脅迫對紫花苜蓿水楊酸和阿魏酸含量的影響Fig．3 Effects of various salt－alkaline mixed stress conditions on the salicylic acid and ferulic acid contents of alfalfa

2．3．2 阿魏酸含量 從圖3 所示，非鹽堿條件（CK）下，接種AMF處理的紫花苜蓿幼苗的阿魏酸含量比未接菌處理的顯著低59．1%（P＜0．01），即接種AMF 抑制了阿魏酸的積累，這可能是由于阿魏酸參與了紫花苜蓿的防御系統(tǒng)抑制AMF 侵染；鹽堿條件下，未接菌處理組和接菌處理組的阿魏酸含量隨著鹽堿梯度的增加而增加，且表現(xiàn)為D＞C＞B＞A，即阿魏酸的積累增加了紫花苜蓿的抗鹽堿性；除了B150接菌處理組比未接菌處理組的顯著高40．5%（P＜0．05）外，其余A、B、C、D 各個處理組的阿魏酸含量接菌的比相應(yīng)未接菌的高但差異不顯著。整體上分析，鹽堿條件下，紫花苜蓿幼苗阿魏酸含量表現(xiàn)為接菌處理組比相應(yīng)未接菌處理組的阿魏酸含量高且差異不顯著（P＞0．05），且受到鹽脅迫（P＜0．001）、堿脅迫（P＜0．001）與接種AMF（P＜0．01）的顯著影響；但是，鹽堿脅迫以及AMF 與鹽脅迫、堿脅迫、鹽堿脅迫之間的交互作用對紫花苜蓿的阿魏酸含量的影響均為差異不顯著（P＞0．05）；說明阿魏酸可能需要調(diào)節(jié)來自于鹽堿脅迫以及AMF侵染兩個方面的影響，導(dǎo)致接種AMF在鹽堿條件下對紫花苜蓿中阿魏酸的含量無影響。

3 討論與結(jié)論

存活率、株高與總生物量可以直接的表現(xiàn)出鹽堿脅迫對植物的生長抑制效應(yīng)。陸爽等［17］與張璐等［18］認為AMF增加了紫花苜蓿根系的吸收面積，促進了宿主植物對養(yǎng)分與水分的吸收，從而提高植株的耐鹽堿性，有利于植物的生長。本研究結(jié)果顯示，AMF能提高紫花苜蓿的存活率、株高與總生物量，這與前人的研究結(jié)果完全一致。

AMF能夠促進宿主植物體內(nèi)脯氨酸、可溶性蛋白質(zhì)的積累，從而維持細胞內(nèi)的滲透勢，保證植物細胞的正常生理代謝，緩解了紫花苜蓿在鹽脅迫下的生長抑制效應(yīng)［27］。脯氨酸是提高植物耐鹽性的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，而且積累脯氨酸是在低水勢情況下保持滲透平衡的一種有效的保護機制［28］。很多研究表明在鹽條件下接種AMF使宿主植物積累更高的脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)的含量［29－31］。本實驗表明，混合鹽堿脅迫下，鹽脅迫引起的水勢與Na＋的變化以及堿濃度引起的高pH 均會誘導(dǎo)植物內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累［9］，且接種AMF會產(chǎn)生更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)降低滲透勢，來提高宿主植物的耐鹽堿適應(yīng)性。

水楊酸是一種重要的信號分子，能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗逆性。Medina等［32］認為水楊酸作為一種防御化合物抵御AMF 侵染宿主植物，所以接菌的植物中水楊酸的含量要低，這與本結(jié)果相符合。但是，在鹽堿條件下，Zhang等［33］認為，AMF 可能是通 過過氧化氫，水楊酸和一氧化氮的級聯(lián)信號通路提高根內(nèi)的酚酸合成來增加宿主植物的抗逆性，這與本結(jié)果不相符。因此，本文認為一方面由于水楊酸的大量積累提高植物的抗氧化酶活性，降低膜脂的過氧化水平，增強植物的抗逆能力，另一方面水楊酸作為防御化合物抵御AMF 的侵染，從而使得接菌植物中的水楊酸含量維持在較低的水平。也有人認為AMF的種類不同，宿主植物不同，采樣時間和所測定的植物器官不同均會影響到水楊酸含量的測定結(jié)果［34］。所以，接種AMF 增加或減少寄主植物中水楊酸水平的原因仍然需要研究。

Medina等［35］研究顯示外源阿魏酸對AMF 的侵染具有一定的抑制作用。這表明植物體內(nèi)的阿魏酸可能抑制AMF的侵染導(dǎo)致宿主植物體內(nèi)的阿魏酸含量降低，從而導(dǎo)致本研究中非鹽堿條件下，接菌處理組的紫花苜蓿中阿魏酸含量低。而李冬美［36］的研究顯示外源阿魏酸能夠提高植物體內(nèi)的抗氧化酶活性。因此，鹽堿梯度的增加導(dǎo)致植物體內(nèi)的阿魏酸積累，從而降低了莖葉組織細胞膜脂的過氧化，進而提高植物的抗鹽堿能力。而阿魏酸是與植物細胞壁相結(jié)合［37］以及相比較于其它酚酸表現(xiàn)出對pH的穩(wěn)定性［38］，可能導(dǎo)致了本研究中鹽堿脅迫下AMF對紫花苜蓿中阿魏酸的含量無影響。

綜上，混合鹽堿脅迫下，接種AMF 能夠促進紫花苜蓿的生理生長，并且酚酸與植物抗逆之間也有密切的聯(lián)系。這有利于探索叢枝菌根真菌對經(jīng)濟作物的生長發(fā)育的促進作用，通過研究逆境下AMF對植物體內(nèi)酚酸含量的影響，從而為其它次級代謝產(chǎn)物對植物耐鹽堿適應(yīng)性的調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)。而且，為鹽漬化土壤治理與植被恢復(fù)提供了重要的經(jīng)濟價值與科學(xué)意義。

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