張婭++金鳳++郭子璇++吳迪++范巍巍++王震宇++杜明

摘要采用水酶法制備虹鱒魚骨油，單因素分析法優(yōu)化虹鱒魚骨酶解的工藝條件，考察了料液比、pH值、酶解時(shí)間、酶解溫度、加酶量5個(gè)因素對(duì)魚油提取率的影響，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用 （GCMS） 技術(shù)對(duì)魚骨油的脂肪酸組成和含量進(jìn)行了分析鑒定。結(jié)果表明，在55℃、pH 7.5、酶解時(shí)間為3 h、料液比為1∶1、加酶量為2000 U/g的條件下，利用堿性蛋白酶提取的虹鱒魚骨油中的油脂含量最高。GCMS分析結(jié)果表明，虹鱒魚骨油中主要成分是不飽和脂肪酸，含量為脂肪酸總量的80.4% （w/w），其中單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸分別約占不飽和脂肪酸的76.9%和23.1% （w/w）， DHA和EPA的總量為3.4% （w/w）。本研究優(yōu)化了虹鱒魚油的提取技術(shù)，對(duì)虹鱒魚油的主要揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了分析鑒定，初步確定了其中對(duì)魚油風(fēng)味起主要貢獻(xiàn)的物質(zhì)，對(duì)魚油產(chǎn)品的分析與鑒別具有參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞魚骨； 水酶法； 魚油； 不飽和脂肪酸； 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用

1引 言

魚類加工中產(chǎn)生的大量魚骨副產(chǎn)物中富含蛋白質(zhì)，目前主要的利用方式是將其加工成飼料，經(jīng)濟(jì)價(jià)值低。虹鱒魚中含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，長期食用能有效防止心血管類疾病，具有降血壓、降血糖、降血脂的功效，被譽(yù)為“水中人參”＼[1＼]。魚油是魚骨中富含的主要功能性成分之一，其主要成分為Omega3脂肪酸，具有抗炎＼[2＼]、降血脂、預(yù)防心血管疾?。躘3，4＼]等作用，是一種具有良好功能的食品原料。

目前，生產(chǎn)魚油的主要方法有蒸煮法＼[5＼]、淡堿液清洗法＼[6，7＼]、溶劑提取法＼[8＼]、水酶法＼[9，10＼]和超臨界流體萃取法＼[11，12＼]。蒸煮法不能將與蛋白質(zhì)相結(jié)合的脂肪分離，提取率較低，而且蒸煮溫度一般為90℃，會(huì)對(duì)魚油品質(zhì)造成不良影響。淡堿液清洗法和溶劑提取法中溶劑不易回收，并可能造成環(huán)境污染。超臨界流體萃取＼[13＼]主要是用于萃取含游離脂肪酸較高的成分，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；肮I(yè)化生產(chǎn)＼[14＼]。相比之下，水酶法提取效率較高，能有效回收原料中蛋白質(zhì)＼[15＼]，且不污染環(huán)境，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

不同來源的魚油其脂肪酸組成存在很大差異。目前針對(duì)深海魚類來源的魚油脂肪酸組成分析的研究較多，但針對(duì)淡水魚尤其是虹鱒魚的魚油的脂肪酸組成的研究卻未見報(bào)道。本研究以虹鱒魚骨為原料，采用水酶法制備魚油，并采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS） 技術(shù)對(duì)虹鱒魚油的脂肪酸組成及其風(fēng)味進(jìn)行了分析，為魚油的檢測(cè)分析及其開發(fā)利用提供了參考。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Atomx/7890B/5977A吹掃捕集氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 （安捷倫科技 （中國） 有限公司）；CF16RXⅡ高速離心機(jī) （日本Hitachi公司）； PB10 pH計(jì) （賽多利斯科技儀器 （北京） 有限公司）；TTLDC多功能氮吹儀 （北京同泰聯(lián)科技術(shù)發(fā)展有限公司）；紫外分光光度計(jì) （上海光譜儀器有限公司），NMI20030H1核磁共振儀（上海紐邁電子科技有限公司）；微波傳感器 （上海福美斯電子科技有限公司）。

堿性蛋白酶 （173168 U/g）、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶（北京寶希迪有限公司）；甲醇 （Methanol，色譜級(jí)）、正己烷 （Hexane， 色譜級(jí)）、Na2CO3、NaOH、CuSO4、酒石酸鉀鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、Li2SO4等試劑（大連博諾有限公司）。Agilent 19091S433UI HP5ms Ultra Inert色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）。虹鱒魚骨由山東悅一生物科技有限公司提供。

2.2蛋白質(zhì)等組分含量測(cè)定

蛋白質(zhì)測(cè)定采用Folin酚試劑法＼[16＼]，脂肪含量測(cè)定采用NMR法＼[17＼]，水分測(cè)定采用微波傳感器法＼[18＼]，灰分測(cè)定采用灰化法＼[19＼]。

2.3魚骨樣品處理方法

魚骨切碎成0.3 cm×0.5 cm的小塊，按料液比1∶2 （w/w），加水?dāng)嚢杈鶆?，高壓蒸?（121℃， 30 min）。然后進(jìn)行勻漿 （5000 r/min， 5 min），將勻漿液調(diào)節(jié)到適宜溫度 （參照表1），用1 mol/L NaOH調(diào)至pH值，加酶 （500 U/g） 水解 3 h，100℃滅活酶10 min，10000 r/min離心20 min，取上層魚油，待測(cè)。

魚油提取率的計(jì)算公式為：

其中，魚骨中所含魚油質(zhì)量即為粗脂肪含量，采用NMR法進(jìn)行快速測(cè)定。

2.4蛋白酶的篩選

本研究選擇5種蛋白酶水解虹鱒魚骨，以魚油提取率為指標(biāo)確定最適合的酶，所選取的各蛋白酶水解條件如表1所示。

2.5脂肪酸組成分析

2.5.1樣品甲酯化取0.02 g 酶解后的魚油于樣品瓶中，加入2 mL 0.5 mol/L KOHCH3OH，密封，60℃水浴孵育2 h。冷卻至室溫，用6 mol/L HCl調(diào)至pH 3～4；加入2 mL 正己烷萃取，重復(fù)3次，35℃下氮吹至恒重。加入0.5 mL色譜級(jí)正己烷，混勻，加入2 mL 1% H2SO4CH3OH，70℃水浴1 h，冷卻至室溫，用去離子水調(diào)至中性，靜置分層后，移取正己烷層，加入無水Na2SO4，過夜，備用。

2.5.2氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析GC條件：Agilent 19091S-433UI HP5ms Ultra Inert毛細(xì)管柱 （30 m×250 μm×0.25 μm）；載氣：高純氦氣；分流比：50∶1；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；升溫程序：柱箱初始溫度50℃，保持1 min，以50℃/min 的速度升溫至170℃，再以4℃/min升溫至300℃，保持15 min；進(jìn)樣量1

SymbolmA@ L。

MS條件：EI離子源，電離能量70 eV，離子源溫度230℃。通過檢索NIST譜庫，對(duì)脂肪酸進(jìn)行定性分析，通過面積歸一化法確定其相對(duì)百分含量。

3結(jié)果與討論

3.1虹鱒魚骨中主要成分含量

虹鱒魚骨是一種高蛋白、高脂肪的原料，測(cè)得虹鱒魚骨中蛋白質(zhì)含量為15.9% （w/w），脂肪含量為17.7% （w/w）。

3.2魚骨水解條件的優(yōu)化

3.2.1水解蛋白酶的選擇5種蛋白酶酶解提取魚油的結(jié)果如圖1所示，其中堿性蛋白酶酶解虹鱒魚骨的油脂提取率明顯高于其它酶，因此選擇用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，并對(duì)虹鱒魚油的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

3.2.2酶解溫度對(duì)魚油提取率的影響如圖2所示，溫度升高，魚油提取率逐漸增加，在55℃時(shí)達(dá)到最大。這是因?yàn)闇囟壬?，酶的活力增?qiáng)，酶解速率加快，當(dāng)溫度達(dá)到一定值后，隨著溫度的升高，酶逐漸失活，提取率下降；同時(shí)，溫度過高會(huì)導(dǎo)致油脂品質(zhì)下降。因此，選取55℃為酶解的最佳溫度。

3.2.3酶解時(shí)間對(duì)魚油提取率的影響如圖3所示，酶解時(shí)間少于3 h時(shí)，油脂提取率隨時(shí)間延長而增大；當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到3 h后，油脂提取率增長速度變慢；同時(shí)，酶解時(shí)間延長，油脂中的不飽和脂肪酸容易氧化變質(zhì)＼[19＼]，因此，選擇3 h為虹鱒魚骨酶解的最佳時(shí)間。

3.2.4pH值對(duì)魚油提取率的影響在最適pH時(shí)，酶表現(xiàn)出最大活性，pH值過低或過高，都會(huì)使酶活性降低，甚至失活。如圖4所示，隨著水解體系pH值增加，魚油提取率先增加后降低，在pH 7.5時(shí)，虹鱒魚骨的油脂提取率到達(dá)最大值。因此本研究選擇pH 7.5為魚骨酶解的初始pH值。

3.2.5加酶量對(duì)魚油提取率的影響如圖5所示，隨著蛋白酶加入量增加，魚油提取率逐漸增大，酶加入量為2000 U/g時(shí)，提取率最大；當(dāng)酶過量時(shí)，酶自身的水解增強(qiáng)，魚油提取率反而降低＼[20＼]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2000 U/g為酶的最適加入量。由于酶加入量為500 U/g與2000 U/g時(shí)魚油提取率的差別不大，考慮到成本，選取500 U/g進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2.6料液比對(duì)魚油提取率的影響如圖6所示，當(dāng)料液比為1∶1時(shí)，油脂提取率最大，之后隨著水加入量增加，提取率逐漸降低，這可能是由于水加入量增加，底物濃度降低，酶的濃度也減小，導(dǎo)致提取率降低。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，虹鱒魚骨油的最佳提取條件為：在55℃、pH 7.5、酶解時(shí)間為3 h、料液比為1∶1、加酶量為500 U/g。在此條件下，利用堿性蛋白酶提取的虹鱒魚骨中的油脂含量最高，提取得到的粗魚油呈橘紅色，油體清澈、透明，魚油香味純正。

3.3虹鱒魚骨脂肪酸組成分析

將提取的虹鱒魚油進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析，所得譜圖見圖7，脂肪酸組成見表2。從表2可知，本研究測(cè)得的虹鱒魚骨油中的脂肪酸共25種，主要在C12～C22之間。其中飽和脂肪酸7種，含量為總脂肪酸的20% （w/w）；其余為不飽和脂肪酸， 占脂肪酸總量的80% （w/w），單不飽和脂肪酸占不飽和脂肪酸的76.9%，多不飽和脂肪酸占23.1%，高于羅非魚內(nèi)臟的63.31% （單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸分別占脂肪酸總量的3813%和25.18% （w/w））。在不飽和脂肪酸中，含量最高的為油酸，其次為亞油酸。脂肪酸是風(fēng)味化合物的重要前體，是揮發(fā)性化合物的主要來源。Caprino等＼[21＼]研究了

白鱘魚的脂肪酸組成及其風(fēng)味化合物，脂肪酸主要是棕櫚酸和油酸，其次是DHA和EPA；主要風(fēng)味化合物是醛類，占揮發(fā)性化合物的60%，對(duì)其風(fēng)味起主要作用的己醛和壬醛是由亞油酸氧化形成的；庚醛和辛醛來源于油酸和亞油酸的氧化。龍斌等＼[22＼]以川鯰為原料，對(duì)其腹部和背部的脂肪酸及揮發(fā)性化合物進(jìn)行測(cè)定。羥基化合物和羰基化合物是最重要的風(fēng)味化合物，尤其是醛類，其中己醛、庚醛、辛醛、壬醛、2，5辛二酮、1辛烯3醇對(duì)川鯰的風(fēng)味影響最為顯著；大多數(shù)醛是不飽和脂肪酸氧化形成，其進(jìn)一步氧化反應(yīng)生成短鏈醛。該研究進(jìn)一步驗(yàn)證了脂肪酸對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味化合物的形成至關(guān)重要。脂肪酸降解后能生成醛類、醇類、烷烴、烯烴等揮發(fā)性風(fēng)味化合物。因此，本研究以提取的虹鱒魚骨油為原料，采用SPMEGCMS對(duì)其揮發(fā)性化合物進(jìn)行了測(cè)定。虹鱒魚油中共檢測(cè)出醇類占14.78%、烷烴34.23%、醛類28.05%、酮類1.96%、苯0.46%、吡嗪10.76%、酸0.63%、酯1.38%、烯烴6.36%、萘0.27%、炔烴1.49%等，其中，醛類、吡嗪是魚油嗅感的主要物質(zhì)。辛烯醛是導(dǎo)致魚油產(chǎn)生腥味的最主要物質(zhì)，它是一種重要的有機(jī)中間體，是生產(chǎn)丁辛醇、香料的重要中間體＼[23＼]。 醛類的氣味閾值較低，是魚油中的多不飽和脂肪酸在酶和微生物的作用下發(fā)生氧化降解而生成的＼[24＼]。在虹鱒魚油揮發(fā)性化合物中，另一個(gè)含量較高的物質(zhì)是N（2丙炔基） 吡咯烷，是由脂肪酸氧自由基均裂產(chǎn)生的，但由于其閾值較高，其對(duì)魚油風(fēng)味的形成直接貢獻(xiàn)不大。在虹鱒魚骨中檢測(cè)出吡嗪類物質(zhì)，包括2乙基5甲基吡嗪 （草味，堅(jiān)果味） 和2，5二甲基吡嗪 （烘烤堅(jiān)果味）＼[25＼]，其中2乙基5甲基吡嗪含量較高，占1.86% （w/w），在虹鱒魚油的風(fēng)味形成中起重要作用。

4結(jié) 論

本研究以虹鱒魚骨為原料，采用水酶法提取魚油，對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。GCMS的分析結(jié)果表明，水酶法所提取的魚油中不飽和脂肪酸占絕大部分（80.4%），其中單不飽和脂肪酸占不飽和脂肪酸的76.9%，多不飽和脂肪酸占不飽和脂肪酸的23.1%， DHA和EPA占總脂肪酸的3.4%。本研究對(duì)魚油產(chǎn)品的分析與鑒別具有參考價(jià)值。

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