鐵線透骨草中槲皮素的提取條件優(yōu)化及含量測定

趙恒成，耿凱凱，李少坡，湯彥豐，李 娜，梁惠花，甄 攀

(河北北方學院，河北 張家口 075000)

鐵線透骨草中槲皮素的提取條件優(yōu)化及含量測定

趙恒成，耿凱凱，李少坡，湯彥豐，李 娜，梁惠花，甄 攀

(河北北方學院，河北 張家口 075000)

目的 利用正交試驗研究鐵線透骨草中槲皮素的最佳提取條件，測定不同批次鐵線透骨草中槲皮素的含量。方法 設(shè)置L9(34)正交試驗，安排提取溫度、溶媒(甲醇)量、提取時間、加鹽酸量4個因素，HPLC法檢測；色譜柱：Hypersil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.1%乙酸(50∶50)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測波長：375 nm。結(jié)果 最佳提取條件為：樣品量約2.0 g，加入35 mL甲醇、10 mL濃鹽酸，浸泡0.5 h，于40 ℃超聲震蕩提取40 min。在此條件下測定的8個批次鐵線透骨草中槲皮素的含量為0.109 9～0.880 3 mg·g-1。結(jié)論 提取方法效率高、時間短、溫度低，是提取鐵線透骨草中槲皮素較好的方法。不同批次鐵線透骨草中槲皮素的含量相差較大。

鐵線透骨草；槲皮素；HPLC；正交試驗

透骨草基源混亂，同名異物現(xiàn)象非常嚴重。據(jù)統(tǒng)計，記載為透骨草的原植物共計21科44種5變種[1,2]。這些來源于不同科屬的商品名均為透骨草的植物，在化學成分、藥理作用、功效和毒性等方面不盡相同[3,4]。在河北、北京、內(nèi)蒙古等北方地區(qū)將黃花鐵線蓮(ClematisintricataBunge)作為透骨草使用，稱為鐵線透骨草。目前對于透骨草的研究大多限于風仙透骨草和珍珠透骨草[5,6]，對于鐵線透骨草的研究報道較少。槲皮素是其重要的黃酮類活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗過敏、抗菌、抗病毒、清除體內(nèi)自由基、抑制惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[7-10]等多方面藥理作用。本文基于均勻設(shè)計方案研究了鐵線透骨草中槲皮素的最佳提取條件，并測定不同批次鐵線透骨草中槲皮素的含量。

1 材料與方法

1.1 藥材

文中所用鐵線透骨草樣品，有6種為張家口市市售藥材，2種由作者采集，均經(jīng)河北北方學院中醫(yī)學院趙恒成老師鑒定為黃花鐵線蓮(ClematisintricataBunge)。正交試驗所用藥材為樣品1。具體如下：

樣品1：2012年3月購自張家口華佗藥房長青路店；

樣品2：2013年4月購自張家口華佗藥房緯一路店；

樣品3：2013年4月購自河北北方學院校醫(yī)院；

樣品4：2013年4月購自張家口華佗藥房長青路店；

樣品5：2013年4月購自張家口德仁堂藥房長青路店；

樣品6：2013年4月購自張家口南山堂藥房公園路店；

樣品7：2010年采自河北涿鹿楊家坪；

樣品8：2013年采自河北涿鹿楊家坪。

1.2 試劑

槲皮素標準品：中國食品藥品檢定研究院提供，批號：100081-200907。

甲醇(色譜純)、濃鹽酸(分析純)、冰乙酸(分析純)。

1.3 主要實驗儀器

Agilent HP1100高效液相色譜儀。

2 方法與結(jié)果

圖1 槲皮素色譜圖 圖2 鐵線透骨草色譜圖

2.1 色譜條件

Hypersil ODS C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色譜柱(美國 Thermo)；甲醇-0.1%冰乙酸溶液(50∶50)為流動相；檢測波長：375 nm；進樣量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃。色譜圖見圖1和圖2，圖中“1”為槲皮素(quercetin)峰。

2.2 標準曲線

精密稱取1.13 mg槲皮素對照品置于50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得22.6 μg·mL-1的槲皮素對照品溶液。

將對照品溶液按倍數(shù)稀釋成0.71、1.41、2.83、5.65、11.3、22.6 μg·mL-1，分別進樣，進樣量20 μL，峰面積分別為48.5、76.8、217.2、483.3、1 025.9、2 174.1 mAU。以槲皮素濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為y=97.931x-55.356，r2=0.9993。線性范圍0.71～22.6 μg·mL-1。

2.3 L9(34)正交試驗

甲醇為提取溶劑，超聲震蕩法提取。以槲皮素含量為指標，設(shè)計L9(34)正交試驗。各樣品的重量約為2.0 g，均精密稱定，用提取溶劑浸泡0.5 h，各試驗均平行2份。實驗因素和水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2。

表1 正交試驗的因素和水平

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果

表3 方差分析表

由正交試驗結(jié)果可知，提取槲皮素的最佳條件為A2B2C3D2，即用35 mL溶媒(甲醇)，10 mL濃鹽酸，浸泡0.5 h，然后于40 ℃超聲震蕩提取40 min。

2.4 方差分析

對以上正交試驗結(jié)果進行方差分析，見表3。

方差分析結(jié)果顯示，槲皮素的提取時間、提取溫度、加濃鹽酸量和溶媒(甲醇)量均為顯著性影響因素(P<0.01)，其中提取時間和溶媒(甲醇)量影響尤其顯著。

2.5 樣品中槲皮素的含量測定

取以上8個批次的鐵線透骨草樣品，按最佳提取條件提取，在上述色譜條件下測定槲皮素的含量。見表4。

表4 樣品中槲皮素的含量

3 討論與結(jié)論

1)藥物分析中，經(jīng)常會遇到多因素多水平的問題，例如提取中草藥中的有效成分，提取效率常受到提取液的種類及組成、提取時間、浸泡時間、溶液的pH等條件的影響。為了尋找最優(yōu)提取條件，常安排多因素多水平正交試驗，通過有限的實驗次數(shù)，再通過合理的統(tǒng)計分析，即可得出最優(yōu)提取條件。但要注意，當正交試驗表中所有因素都排滿時，要進行重復試驗，否則無法進行方差分析。

2)前期試驗研究了加酸和不加酸對槲皮素含量的影響，結(jié)果表明加酸后槲皮素的含量有顯著提高，所以本試驗探討了加酸量的影響。前期試驗中比較了冷浸取、超聲提取、索氏提取和回流提取對槲皮素含量的影響，結(jié)果是超聲提取效果更佳，所以本實驗采用超聲提取法。用本文得到的方法提取槲皮素，效率高、時間短、溫度低，是提取鐵線透骨草中槲皮素較好的方法。

3)8個批次鐵線透骨草中槲皮素的含量為0.109 9～0.880 3 mg·g-1，而且色譜圖也有區(qū)別，說明不同批次鐵線透骨草中槲皮素的含量相差較大，化學成分不盡相同，可能與其生長環(huán)境有關(guān)。

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[責任編輯：劉守義 英文編輯：劉彥哲]

Optimization of Extraction Conditions and Determination of Quercetin fromClematisIntricataBunge

ZHAO Heng-cheng,GENG Kai-kai,LI Shao-po, TANG Yan-feng，Li Na，LIANG Hui-hua，ZHEN Pan

(Hebei North University，Zhangjiakou,Hebei 075000，China)

Objective To study the optimal extraction conditions of quercetin fromClematisintricataBungeby orthogonal test and determine contents of quercetin in different batches ofClematisintricataBunge.Methods Setting the L9(34)orthogonal test table,arranging four factors:extraction temperature,amount of solvent(methanol),extraction time and amount of hydrochloric acid.Detecting by HPLC;column:Hypersil C18(5μm,4.6 mm×250 mm),mobile phase:CH3OH-0.1% CH3COOH(50∶50),flow rate:1.0 mL/min,column temperature:25 ℃;determining wavelength:375 nm.Results The optimal condition was that the sample with about 2.0 g conical flask with plug was poured 35 mL CH3OH and 10 mL concentrated hydrochloric acid,then was soaked about 0.5 h,and extraced 40 min at the temperature of 40 ℃ with ultrasound concussion.Conclusion The extraction method could have high efficiency,short time and low temperature,and be better to extract quercetin fromClematisIntricataBunge.The contents of quercetin could differ significantly in different batches ofClematisIntricataBunge.

ClematisintricataBunge；quercetin；HPLC；orthogonal test

河北省中藥局資助項目(2013077)；河北北方學院應(yīng)用化學創(chuàng)新團隊(CXTD1306)

趙恒成(1963-)，男，山東武城人，河北北方學院中醫(yī)學院實驗師。

甄攀(1965-)，女，河北曲陽人，碩士，教授，碩士生導師，研究方向為藥物化學及藥物分析。

R 284.1

A

10.3969/j.issn.1673-1492.2015.02.004

來稿日期：2014-12-04