司來吉蘭對帕金森病模型大鼠結腸α-突觸核蛋白和神經元型一氧化氮合酶表達的影響

畢樹立 劉斌 成曉華 高海英 李世英

司來吉蘭對帕金森病模型大鼠結腸α-突觸核蛋白和神經元型一氧化氮合酶表達的影響

畢樹立 劉斌 成曉華 高海英 李世英

目的 觀察司來吉蘭(selegiline)對帕金森病(Parkinson disease，PD)模型大鼠結腸功能障礙及結腸α-突觸核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)及神經元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)表達的影響，探討司來吉蘭對PD患者結腸功能障礙的治療作用及可能機制。方法 將72只健康SD大鼠隨機分為正常對照組、PD模型組和司來吉蘭治療組，后兩組采用頸背部皮下注射魚藤酮方法制備PD模型。模型組每天給予生理鹽水灌胃，治療組每天給予司來吉蘭0.5 mg/kg灌胃。分別于治療后4 d、8 d測定大鼠1 h糞便排出量及含水量，并采用免疫組化法和蛋白質印跡法檢測結腸α-Syn和nNOS的表達。結果 (1)與對照組比較，模型組各時間點1 h糞便排出量及含水量均減少 (均P<0.01)；與模型組相比較，治療組各時間點1 h糞便排出量及含水量均增加(均P<0.05)，且治療8 d亞組高于治療4 d亞組(均P<0.05)。(2)與對照組比較，模型組各時間點結腸α-Syn、nNOS表達均增加(均P<0.01)；與模型組比較，治療組各時間點結腸α-Syn、nNOS表達均降低(均P<0.05)。與治療4 d亞組比較，治療8 d亞組的α-Syn、nNOS表達含量降低(均P<0.05)。結論 司來吉蘭能夠改善PD大鼠結腸功能障礙，其作用機制可能與其抑制α-Syn、nNOS表達有關。

帕金森??；α突觸核蛋白；一氧化氮合酶；結腸；司來吉蘭

帕金森病(Parkinsondisease，PD)患者常伴便秘等腸道功能障礙[1]。PD典型的病理改變是黑質多巴胺能神經元胞質內出現(xiàn)形成路易體(Lewybody，LB) ，而α-突觸核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)是LB的主要成分，其能減少多巴胺的釋放，同時在肌間及黏膜下神經叢神經元也存在相同的改變[2]。Drolet等[3]研究發(fā)現(xiàn), 隨著便秘等腸道功能紊亂癥狀的出現(xiàn)，PD大鼠腸神經系統(tǒng)會出現(xiàn)α-Syn的聚集，提示α-Syn的聚集與便秘相關。一氧化氮(NO)是腸神經系統(tǒng)內最主要的抑制性神經遞質之一，在體內由一氧化氮合酶(NOS)催化產生，介導平滑肌的松弛效應。在PD大鼠的腸肌叢，特別是在NO能神經元中發(fā)現(xiàn)存在α-Syn陽性包涵體，證實NO能神經元受損可能與PD腸功能障礙有關[4]。司來吉蘭是一種單胺氧化酶B抑制劑，具有抗氧化應激、保護線粒體功能、減少炎性反應及減少興奮性毒性等神經保護作用，可延緩PD的進展，但其對PD模型大鼠結腸功能障礙有何影響尚不明確[5]。本研究采用頸背部皮下注射魚藤酮制備PD大鼠模型，觀察司來吉蘭對PD模型大鼠結腸α-Syn和nNOS表達的影響，探討司來吉蘭對PD患者結腸功能障礙的治療機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 司來吉蘭(批號H20040400，規(guī)格5mg/片)，購自OrionCorporationEspoo(Finland)；魚藤酮(批號201212，粉劑，1g/瓶)購自北京博奧森生物工程有限公司；市售葵花油；SP-0023免疫組化試劑盒(批號201302)、兔抗大鼠α-Syn抗體(批號：130926，0.1mL/支)和兔抗大鼠nNOS抗體(批號：909086W，0.1mL/支)均購自北京博奧森生物工程有限公司；DAB顯色試劑盒(批號：375230AJ，3mL/支)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳低分子量標準蛋白購自華美生物工程有限公司；奧林巴斯BX63全自動顯微鏡掃描系統(tǒng)由日本奧林巴斯公司提供。

1.2 實驗動物 健康雄性SD大鼠72只，體質量250～300g，3～4月齡，由北京華阜康生物科技股份有限公司供給，合格證號：SCXK(京)2013-0013。在河北聯(lián)合大學屏障環(huán)境動物實驗室飼養(yǎng)，室溫控制在(23±2)℃，自然光照，自由進食。適應飼養(yǎng)2周后，將大鼠隨機分為正常對照組、PD模型組和司來吉蘭治療組，并根據(jù)預實驗結果將各組隨機分為模型制備成功后4d、8d兩亞組。每組各12只大鼠，其中6只用于免疫組織化學法檢測，6只用于Westernblotting法檢測。

1.3 方法

1.3.1PD模型制備：采用頸背部皮下注射魚藤酮制備PD模型[6]。以出現(xiàn)行為學改變作為判定模型成功的指標[7]。以行為學檢測評分2～6分的大鼠為PD造模成功標準。

1.3.2 干預處理：模型制備成功后，對照組和模型組每天給生理鹽水灌胃，治療組每天給予司來吉蘭0.5mg/kg灌胃，分別連續(xù)給藥4d和8d。

1.3.3 1h糞便排出量及含水量測定：參照朱紅燦等[4]方法檢測。

1.3.4 免疫組化法檢測α-Syn和nNOS表達：按試劑說明書操作要求檢測各組α-Syn和nNOS陽性細胞表達。各組分別取6只大鼠，用10%(質量濃度)水合氯醛(3mL/kg)腹腔麻醉動物，麻醉后經4%(質量濃度)多聚甲醛灌流固定，剖腹后取大鼠結腸1.5～2.0cm，清洗干凈結腸內容物，剪去結腸周圍的脂肪和結締組織，用4%(質量濃度)多聚甲醛固定24h。常規(guī)包埋、切片、脫蠟、水化、抗原修復；置0.3%(質量分數(shù))過氧化氫20min，分別加入α-Syn抗體、nNOS抗體，4℃孵育過夜；PBS浸洗 5min×3 次，加入HRP標記二抗，37℃孵育 60min；PBS浸洗 5min×3 次。DAB顯色，選取位置相近，結構相似的結腸部位，并于400倍鏡下選取互不重疊的6個視野，觀察每個視野中每100個細胞中α-Syn或nNOS陽性細胞的個數(shù)，取其平均值。

1.3.5 蛋白質印跡法檢測α-Syn和nNOS蛋白表達：各組分別取6只大鼠，用10%(質量濃度)水合氯醛(3mL/kg)腹腔麻醉動物，取結腸1.5～2.0cm，清洗干凈結腸內容物，剪去結腸周圍的脂肪和結締組織，即刻投入液氮，然后放入EP管中-80℃保存。取上述保存的冷凍結腸，提取結腸組織蛋白80μg，15%(質量濃度)SDS-PAGE電泳分離，以濕轉法電轉移至PVDF膜上，封閉液中封閉1h，然后分別加入稀釋好的Ⅰ抗α-Syn(1∶1000)、nNOS(1∶1000)，4℃孵育過夜，PBS洗膜，加入相應稀釋好的二抗(羊抗兔1∶2000)，37℃反應1h，洗膜，以ECL顯色，膠片曝光顯影，結果用ImageJ圖像程序分析軟件分析目的蛋白條帶及內參的吸光度值，以兩者的比值反映目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組大鼠1h糞便排出量及含水率 模型組大鼠各時間點1h糞便排出量及含水率均低于對照組(均P<0.01)；治療組大鼠各時間點1h糞便排出量及含水率均高于模型組(P<0.05)，且治療后8d亞組大鼠1h糞便排出量及含水率高于治療4d亞組(P<0.05)(表1)。

2.2 各組大鼠結腸α-Syn和nNOS免疫組化檢測 對照組大鼠各時間點結腸可見少量α-Syn和nNOS陽性細胞表達。與對照組比較，模型組各時間點結腸α-Syn和nNOS陽性細胞表達均明顯增加(均P<0.01)；與模型組比較，治療組各時間點結腸α-Syn和nNOS陽性細胞表達均明顯減少(均P<0.01)；與治療4d組比較，治療8d組大鼠各時間點結腸α-Syn和nNOS陽性細胞數(shù)降低(P<0.05)(表2)。

2.3 各組大鼠結腸α-Syn和nNOS蛋白表達 對照組大鼠各時間點結腸可見少量α-Syn和nNOS蛋白表達。與對照組比較，模型組各時間點結腸α-Syn和nNOS蛋白表達均明顯增加(均P<0.01)；與模型組比較，治療組各時間點結腸α-Syn和nNOS蛋白表達均明顯減少(均P<0.01)；與治療4d組比較，治療8d組大鼠各時間點結腸α-Syn和nNOS蛋白表達降低(均P<0.05)(表3，圖1～2)。

表 1 各組大鼠1 h糞便排出量及含水率的比較

注:與對照組比，*P<0. 01；與模型組比，△P<0.05， △△P<0.01；與治療4天組比，▲P<0.05。表2、3同

表 2 各組大鼠結腸α-Syn、nNOS陽性細胞數(shù)比較,個/高倍視野)

表 3 各組大鼠結腸α-Syn和nNOS蛋白表達檢測(Western blot)結果

圖1 各組大鼠結腸α-Syn蛋白 Western blotting結果

圖2 各組大鼠結腸nNOS蛋白Western blotting結果

3 討論

PD是一種常見中老年人的神經系統(tǒng)慢性退行性疾病，靜止性震顫、肌強直、運動遲緩及姿勢步態(tài)異常是其主要臨床癥狀[8]，但常伴便秘等腸道功能障礙[1]。PD的腸功能紊亂等非運動系統(tǒng)癥狀越來越受到臨床關注[9]，而便秘是PD患者腸功能紊亂的常見主訴[10]。研究表明，便秘的發(fā)生甚至早于PD運動障礙癥狀的出現(xiàn)[11]，更有甚者，PD患者便秘早于錐體外系癥狀出現(xiàn)前10～20年[12]。本研究結果表明PD模型組大鼠1 h糞便排出量及含水量顯著低于對照組，表明PD模型組大鼠結腸排空速度明顯減慢，PD可引起結腸功能障礙。這與Greene等[10]報道的結果相一致。

中腦黑質多巴胺能神經元的變性丟失是PD 的主要病理改變，但PD腸功能障礙的發(fā)生機制目前尚不清楚。Lebouvier等[13]通過結腸鏡取黏膜下叢組織活檢證實PD患者黏膜下叢存在α-Syn，并且黏膜下叢存在α-Syn的患者便秘的發(fā)生率明顯高于對照組。研究[2]發(fā)現(xiàn)，大腦和黏膜下神經叢都存在LB和α-Syn免疫反應的包涵體，認為PD病理改變可能開始于腸神經系統(tǒng)，并通過分布到腸道的迷走神經節(jié)前纖維逆行傳入到中樞。朱紅燦等[4]研究發(fā)現(xiàn)，6-羥基多巴胺(6-OHDA)組大鼠結腸肌間神經叢α-Syn表達顯著增強，過度表達會導致細胞氧化應激增強，影響細胞的功能，從而引起腸功能障礙，進而推測PD患者便秘可能部分是由于直接損害腸神經系統(tǒng)所造成。NO是一種自由基性質的氣體，NO可通過提高胃腸平滑肌內環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)的濃度而導致平滑肌松弛，引起胃腸運動減弱；NO的半衰期短而難以控制，而NOS則相對穩(wěn)定，NOS廣泛分布于神經元中，并在神經系統(tǒng)損傷中的表達變化成為研究熱點。一般將 NOS 分為神經元型(nNOS)、內皮型(eNOS)和誘導型(iNOS)。有報道[14]PD患者出現(xiàn)的便秘可能是由于nNOS在胃腸道蠕動反射中介導的下行性抑制作用受損所造成；另有學者報道，在采用 6-OHDA制備的PD模型的研究中，PD組nNOS陽性神經元和 nNOSmRNA 表達明顯升高[15]，而另一項研究結果則與之相反[16]。本研究的免疫組化法和蛋白質印跡檢測結果均顯示，模型組大鼠結腸α-Syn和nNOS的陽性細胞和蛋白表達均明顯增多，表明結腸α-Syn和nNOS在PD的腸功能障礙發(fā)病中起重要作用。

司來吉蘭(Selegiline)是一種常用的單胺氧化酶B抑制劑，它能選擇性地抑制紋狀體內促使多巴胺降解為高香草酸的單胺氧化酶(MAO-B)，增加多巴胺的蓄積濃度；同時也減少多巴胺能神經元突觸前膜對多巴胺的再攝取，促進了多巴胺的釋放，延長外源性及內源性多巴胺的作用時間，使PD患者的臨床癥狀得以改善[17]，可用于PD 早期單藥治療及出現(xiàn)癥狀波動后的輔助治療，司來吉蘭具有神經保護作用[18]，能夠減慢和延緩疾病的進展，從而阻止PD進展。本研究各組大鼠1 h糞便排出量及含水量比較的結果顯示，經司來吉蘭治療后，PD模型大鼠結腸排空速度明顯增快，同時，本研究的免疫組化法和蛋白質印跡檢測結果均顯示，司來吉蘭組大鼠結腸α-Syn和nNOS的表達含量均明顯減少，并且隨著時間的進展減少更明顯，表明司來吉蘭可能通過抑制PD大鼠α-Syn和nNOS的表達，發(fā)揮對結腸的保護作用，隨著時間的延長，作用更明顯。由此可知，司來吉蘭能夠改善PD患者的結腸功能障礙，其作用機制可能與其抑制PD模型大鼠結腸α-Syn和nNOS的表達有關。這可能為PD患者結腸功能障礙的防治提供了一定的理論依據(jù)。

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(本文編輯：時秋寬)

Effects of selegiline on the expression of α-synuclein and neuronal nitric oxide synthase in colon of Parkinson’s disease model rats

BIShuli,LIUBin*,CHENGXiaohua,GAOHaiying,LIShiying.

*First Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Hebei United University, Tangshan Hebei 063000, China

LIUBin,Email:liubintsh@126.com

ObjectiveToobservetheeffectsofselegilineoncolonicdysfunction,α-synuclein(α-Syn)andneuronalnitricoxidesynthase(nNOS)expressionsincolonofratmodelofParkinson’sdisease(PD),thentoinvestigatethetherapeuticaleffectandmechanismofselegilineoncolonicdysfunctionofPDpatients.MethodsSeventy-twoSDratswererandomlydividedintonormalcontrolgroup,PDmodelgroup,andselegilinetreatmentgroup.PDratsmodelwereestablishedbysubcutaneousrotenoneinjection.Afterthesuccessofmodelpreparation,PDgroupwasgivennormalsalinedaily,andtherapygroupwasgivenselegiline0.5mg/kgbyintragastricadministration.Atthetimepointof4dand8daftertherapy, 1hfecalexcretionandwatercontentwasassessed,andtheexpressionofα-SynandnNOSweredetectedbyimmunohistochemistryandwesternblotting.Results(1)Comparedwithcontrolgroup,modelgrouphadlower1hfecalexcretionandwatercontentateachtimepoint,andthedifferenceswerestatisticallysignificant(allP<0.01).Comparedwithmodelgroup, 1hfecalexcretionandwatercontentwereallincreasedintherapygroupateachtimepoint(allP<0.05),andintreatment8dsubgroup1hfecalexcretionandwatercontentwerehigherthanthoseoftreatment4dsubgroup(allP<0.05). (2)Comparedwithcontrolgroup,inmodelgroupateachtimepoint,theexpressionsofα-SynandnNOSweresignificantlyincreased(allP<0.01).Comparedwithmodelgroup,intreatmentgroupateachtimepoint,theexpressionsofα-SynandnNOSpositivewerealldecreased(allP<0.05);comparedwithtreatment4dsubgroup,theexpressionsofα-SynandnNOSweredecreasedintreatment8daysubgroup(allP<0.05).ConclusionsSelegilinecanimprovecolonicdysfunctioninPDrats,anditsmechanismmayberelatedtotheinhibitionofα-SynandnNOSexpressionsincolonofPDmodelrats.

Parkinson’sdisease;alpha-synuclein;nitricoxidesynthase;colon;selegiline

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.01.007

唐山市科學技術研究與發(fā)展指導計劃資助項目(項目編號: 13130292a)

063000 河北聯(lián)合大學附屬醫(yī)院神經內一科〔畢樹立(現(xiàn)工作于開平區(qū)醫(yī)院急診科)、劉斌、成曉華、李世英〕；063300 唐山市豐南區(qū)醫(yī)院神經內科 (高海英)

劉斌，Email:liubintsh@126.com

R742.5

A

1006-2963 (2015)01-0025-05

2014-07-27)