腦血流低灌注對大鼠突觸后致密物結(jié)構(gòu)及PSD-95蛋白表達(dá)的影響

歐陽俊搖 王蕾 張秋霞 王雅麗 張建 龍建飛 趙暉

腦血流低灌注對大鼠突觸后致密物結(jié)構(gòu)及PSD-95蛋白表達(dá)的影響

歐陽俊搖 王蕾 張秋霞 王雅麗 張建 龍建飛 趙暉

目的 研究腦血流低灌注對大鼠學(xué)習(xí)記憶、腦組織突觸后致密物(postsynaptic density，PSD)超微結(jié)構(gòu)及PSD-95蛋白表達(dá)的影響。方法 利用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎制備SD大鼠腦血流低灌注模型。將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和腦血流低灌注模型組。采用Morris水迷宮檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶情況。采用透射電鏡結(jié)合Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)定量分析大鼠海馬突觸數(shù)量、PSD長度和厚度。采用免疫組化觀察大鼠腦組織PSD-95的表達(dá)。結(jié)果 腦血流低灌注大鼠空間參考記憶及工作記憶能力減退，在第2至4天游泳訓(xùn)練時間段，搜尋隱藏平臺路徑較假手術(shù)組明顯增加(P<0.05)；撤離平臺后，在原平臺象限游泳時間及路徑較假手術(shù)組降低，準(zhǔn)確穿越原平臺所在位置次數(shù)減少(P<0.05)；當(dāng)平臺移動到第Ⅱ、Ⅳ象限時，搜索移動平臺路徑較假手術(shù)組明顯延長(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，腦血流低灌注大鼠海馬突觸數(shù)量明顯減少，PSD長度變短，厚度變薄(P<0.05)；海馬CA1區(qū)、丘腦前內(nèi)側(cè)核、顳葉皮層PSD-95積分吸光度降低(P<0.05)。結(jié)論 腦血流低灌注所致學(xué)習(xí)記憶功能減退與海馬突觸后致密物結(jié)構(gòu)損傷、PSD-95蛋白表達(dá)下降有關(guān)。

腦血流低灌注；學(xué)習(xí)記憶；突觸后致密物；PSD-95

長期腦灌注不足是血管性癡呆形成的重要病理機(jī)制，發(fā)病早期主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙，最終可導(dǎo)致持久或進(jìn)展性的認(rèn)知與神經(jīng)功能障礙[1]。突觸是神經(jīng)信息傳遞的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，附著于突觸后膜、由多個蛋白復(fù)合體組成的突觸后致密物(postsynapticdensity,PSD) 作為突觸水平信號整合的中心環(huán)節(jié)，可改變神經(jīng)信號傳遞的下游效應(yīng)，調(diào)節(jié)突觸可觸性變化[2]。PSD-95是PSD上含量最豐富的支架蛋白，在介導(dǎo)和整合突觸信號傳遞過程起到了重要作用[3]。PSD容易受突觸前神經(jīng)沖動傳入及內(nèi)外環(huán)境的影響而發(fā)生形態(tài)變化，具有很強(qiáng)的可塑性，雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎大鼠是公認(rèn)的研究腦血流低灌注的動物模型。本實驗通過觀察腦血流低灌注模型大鼠PSD超微結(jié)構(gòu)及PSD-95蛋白表達(dá)變化，旨在從突觸可塑性角度探討腦血流低灌注對學(xué)習(xí)記憶功能的損害機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠25只〔北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001〕，體質(zhì)量180～220g。動物飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗室，動物實驗設(shè)施許可證號：SYXK(JING)2010-0020。采用隨機(jī)數(shù)字法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=10)，腦血流低灌注模型組(以下簡稱模型組，n=15)。

1.2 主要試劑及儀器 包括PSD-95(博奧森，bs-0179R)、濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋公司)、羊血清工作液(北京中杉金橋公司)、透射電鏡(HITACHI)、Centrifuge5810R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)、ASP300 全自動脫水機(jī)(Leica)、Eclipse生物顯微鏡(Nikon)、NIS-ElementsBasicResearch圖像采集分析系統(tǒng)(Nikon)。

1.3 方法

1.3.1 腦血流低灌注模型制作：參考文獻(xiàn)[1]制備雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎(2VO)大鼠模型。頸部皮膚去毛消毒，正中切口，鈍性分離，暴露雙側(cè)頸總動脈，切勿損傷迷走神經(jīng)，絲線結(jié)扎兩側(cè)頸總動脈, 逐層縫合傷口。假手術(shù)組大鼠僅分離雙側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎。

1.3.2 學(xué)習(xí)記憶功能檢測：雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎術(shù)后40d利用Morris水迷宮檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。造模期間，模型組死亡5只大鼠。學(xué)習(xí)記憶功能檢測包括空間參考記憶能力測試及工作記憶能力的測試。平臺放在水池西南象限(第Ⅲ象限)正中距池壁22cm處，水迷宮周圍標(biāo)志物固定，以供大鼠定位平臺。(1)空間參考記憶能力測試：1)隱藏平臺獲得實驗：大鼠入池位置分別為平臺所對及相鄰象限，記錄大鼠在90s內(nèi)成功進(jìn)駐平臺(找到平臺并滯留5s)游泳路徑，如在90s內(nèi)大鼠不能成功進(jìn)駐平臺，將大鼠引上平臺停留5s，引導(dǎo)其學(xué)習(xí)與記憶。每只大鼠每天訓(xùn)練4次，計算大鼠每天尋找平臺游泳路徑平均值。2)空間搜索實驗：隱藏平臺獲得實驗結(jié)束后第5天撤除平臺，在平臺相鄰象限將大鼠面向池壁放入水中，在30s內(nèi)觀察并計算大鼠在原平臺象限(第Ⅲ象限)游泳時間與總游泳時間比值(tP/tT)、原平臺象限(第Ⅲ象限)游泳路徑與總游泳路徑比值(dP/dT)。(2)工作記憶能力的測試：將平臺分別移動到第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限，記錄90s內(nèi)大鼠搜索平臺的游泳距離。學(xué)習(xí)記憶功能檢測結(jié)束后，每組隨機(jī)取6只大鼠，腦組織取材，分別進(jìn)行透射電鏡觀察和免疫組化染色，其余動物腦組織取材后，置液氮備存。

1.3.3 透射電鏡觀察：各組動物完成學(xué)習(xí)記憶功能檢測后，每組隨機(jī)取2只大鼠，將大鼠麻醉后以4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛-2.5%(質(zhì)量濃度)戊二醛-0.1mol/LPB緩沖液灌注固定，斷頭取海馬CA1區(qū)組織1mm×3mm×5mm，放入2.5%(質(zhì)量濃度)戊二醛后固定。常規(guī)方法進(jìn)行組織修塊、超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡(×4萬倍)觀察組織超微結(jié)構(gòu)。每張切片均按從左上向右下的順序進(jìn)行全視野觀察，并對突觸進(jìn)行拍照。采用ImageProPlus圖像分析系統(tǒng)，對突觸數(shù)量進(jìn)行計數(shù)，對PSD長度、厚度進(jìn)行定量統(tǒng)計。

1.3.4 免疫組化染色檢測PSD-95表達(dá)：各組動物完成學(xué)習(xí)記憶功能檢測后，每組隨機(jī)取4只大鼠，將大鼠麻醉后以4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛灌注固定，常規(guī)方法制備腦組織切片，進(jìn)行PSD-95免疫組化染色。檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)高熱修復(fù)20min暴露抗原；兔抗PSD-95(抗體稀釋濃度1∶100)，4℃孵育40h；每片滴加二抗50μL，37℃孵育2h，DAB顯色1min。陰性對照用磷酸鹽緩沖液取代一抗，其余步驟同前。在Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察切片，LEICA數(shù)字顯微照相機(jī)采集圖像，400倍光鏡下采集海馬CA1、顳葉皮層5個視野及丘腦前內(nèi)側(cè)核4個視野，利用NIS-ElementsBasicResearch圖像采集分析分析每個視野下PSD-95陽性表達(dá)的積分吸光度。

2 結(jié)果

2.1 腦血流低灌注對大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

2.1.1 腦血流低灌注對大鼠空間參考記憶的影響：隱藏平臺獲得實驗結(jié)果顯示，假手術(shù)組和模型組大鼠第1天尋找隱藏平臺時間和路徑未見統(tǒng)計學(xué)差異；在第2～4天游泳訓(xùn)練時間段，模型組大鼠搜尋隱藏平臺路徑較假手術(shù)組明顯增加(P<0.05，表1)。

空間探索實驗結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在原平臺象限游泳時間、游泳路徑減少，tP/tT、dP/dT降低，準(zhǔn)確穿越原平臺所在位置次數(shù)也明顯減少(P<0.05，表2)。

表 1 各組大鼠搜尋隱藏平臺游泳路徑(Morris水迷宮)比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05

組別n空間探索能力tP/tT(%) dP/dT(%) 穿環(huán)次數(shù)搜尋移動平臺游泳路徑(cm)Ⅰ象限Ⅱ象限Ⅳ象限假手術(shù)組100.42±0.110.36±0.092.50±0.71908.49±710.681338.02±715.32968.95±615.43模型組100.27±0.06*0.25±0.07*1.50±0.97*1280.99±926.562107.64±638.69*1723.49±606.80*

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05

2.1.2 腦血流低灌注對大鼠工作記憶的影響 空間搜索實驗后，將水迷宮平臺分別置于第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限，檢測結(jié)果顯示，當(dāng)平臺移動到第Ⅱ、Ⅳ象限時，模型組大鼠搜索平臺路徑較假手術(shù)組明顯延長(P<0.05，表2)。

2.2 慢性腦血流低灌注對大鼠PSD結(jié)構(gòu)的影響 假手術(shù)組大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)完整清晰，突觸前膜有少量囊泡聚集，突觸間隙明顯，PSD較長且厚度大，線粒體豐富，可見清晰的線粒體嵴。模型組大鼠海馬突觸數(shù)量明顯減少，突觸結(jié)構(gòu)模糊不完整，PSD長度較假手術(shù)組變短，厚度較假手術(shù)組變薄(P<0.05，圖1，表3)。

2.3 腦血流低灌注對大鼠突觸后PSD-95蛋白表達(dá)的影響 免疫組化染色顯示PSD-95陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈淡棕黃色至深棕黃色。模型組大鼠海馬CA1區(qū)、丘腦前內(nèi)側(cè)核、顳葉皮層PSD-95蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯減少(P<0.05，表4、圖2)。

注：PSD：突觸后致密物；A：假手術(shù)組；B：模型組

圖1 透射電鏡觀察腦血流低灌注大鼠海馬突觸超微結(jié)構(gòu)(箭頭所示為PSD)

表 3 各組大鼠海馬突觸超微結(jié)構(gòu)的變化比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05

表 4 免疫組化法檢測各組大鼠不同腦組織PSD-95表達(dá)積分吸光度變化±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05

圖2 各組大鼠腦組織PSD-95表達(dá)(箭頭所示為PSD-95，免疫組化，DAB顯色)

3 討論

近幾年的研究表明，頸部血管逐漸狹窄引起長期慢性腦供血不足是血管性認(rèn)知障礙形成的重要因素之一[1]。采用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎復(fù)制大鼠腦血流低灌注模型是目前公認(rèn)的研究腦血流低灌注的動物模型，該模型能較好地模擬人類由于血管粥樣硬化導(dǎo)致頭頸動脈逐漸狹窄所致的慢性大腦供血不足[1]。研究結(jié)果顯示，結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈早期可造成急性腦缺血，動物可以通過基底動脈和基底動脈環(huán)血流調(diào)節(jié)以及逐漸形成的側(cè)支循環(huán)來改善和代償供血，使腦血流量趨于穩(wěn)定，持久雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎形成慢性大腦供血不足，結(jié)扎0～21 d大腦頂葉皮層血流量減少至47%,結(jié)扎7 d后腦白質(zhì)血流量減少18%～28%[4]。其病理學(xué)改變主要表現(xiàn)為海馬神經(jīng)元損傷、突觸丟失，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能下降、學(xué)習(xí)記憶障礙[5]。

本實驗利用Morris水迷宮測試大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，在空間參考記憶檢測過程中，大鼠在多次的訓(xùn)練中學(xué)會尋找固定位置的平臺，形成穩(wěn)定的空間位置認(rèn)知，從信息的加工和提取方式來看，這種空間參考記憶進(jìn)入意識系統(tǒng)，其儲存的機(jī)制主要涉及邊緣系統(tǒng)(如海馬)以及大腦皮質(zhì)有關(guān)腦區(qū)，常伴有Hebb突觸修飾[6-7]，屬于陳述性記憶(declarative memory)。而工作記憶為動物和人類提供了對外部世界作出反應(yīng)的快速機(jī)制，其建立不需要內(nèi)側(cè)顳葉和海馬的參與，讀出過程不需要意識的參與[8]。該研究結(jié)果顯示，在檢測過程中，腦血流低灌注大鼠空間參考記憶能力降低，搜索固定位置平臺的游泳路徑明顯延長，并在空間探索實驗中存在定位記憶障礙，穿越平臺位置的次數(shù)減少，同時慢性腦血流低灌注大鼠出現(xiàn)工作記憶能力下降，移動平臺位置后，搜尋移動平臺的游泳路徑明顯比假手術(shù)組延長。

突觸是神經(jīng)元之間進(jìn)行信息交流的關(guān)鍵部位，突觸的可塑性和長時程增強(qiáng)(Long-term potentiation，LTP)與學(xué)習(xí)記憶的細(xì)胞分子機(jī)制有關(guān)。腦灌注減少可影響糖和氧的正常傳遞，導(dǎo)致腦細(xì)胞生物合成及突觸通路的能量代謝衰竭[9-10]，通過透射電鏡該文作者觀察到腦血流低灌注大鼠海馬突觸數(shù)量減少，PSD厚度變薄，長度明顯縮短，表明腦血流低灌注狀態(tài)導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能減退與海馬PSD結(jié)構(gòu)損傷、PSD-95蛋白表達(dá)下降有關(guān)。相關(guān)研究表明PSD厚度及活性區(qū)長度變化可影響突觸可塑性，是LTP形成的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。鈣離子/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-depended protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)在PSD部位通過磷酸化N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)參與LTP 的誘導(dǎo)與維持，LTP形成后，突觸PSD厚度、面積增大[11]。自然衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶功能力與腦內(nèi)皮層、海馬PSD厚度減少有平行關(guān)系，東莨菪堿或高鈣在損傷小鼠學(xué)憶記憶的同時也引起海馬突觸PSD厚度減小一致[12]。

PSD中所含的各種蛋白質(zhì)和酶的構(gòu)象和數(shù)量的變化都會導(dǎo)致PSD形態(tài)變化[13]，PSD-95是PSD最重要的支架蛋白，作為膜相關(guān)鳥苷酸激酶(membrane-associated granulate kinase，MAGUK)蛋白超家族中的成員[14],可直接調(diào)控NMDA受體在突觸后膜的簇集和谷氨酸通路的活性[15]，對維持PSD的構(gòu)架和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起重要作用。本實驗采用免疫組化方法對腦組織PSD蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示腦血流低灌注大鼠海馬CA1區(qū)、丘腦前內(nèi)側(cè)核、顳葉皮層PSD-95蛋白表達(dá)均較假手術(shù)組明顯減少。結(jié)合學(xué)習(xí)記憶功能檢測結(jié)果，表明腦血流低灌注可減少突觸數(shù)量、損傷突觸結(jié)構(gòu)，并通過降低PSD-95蛋白表達(dá)影響突觸可塑性，最終導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能損害。

近年來突觸功能與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系日益受到關(guān)注，PSD在調(diào)節(jié)突觸可塑性方面起著關(guān)鍵的作用。通過對PSD關(guān)鍵蛋白、基因表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，改善突觸功能，增強(qiáng)突觸傳遞將成為疾病的治療提供新的思路和方法。

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(本文編輯：時秋寬)

The influence of cerebral hypo-perfusion on postsynaptic density structure and postsynaptic density -95 protein expression in rats

OUYANGJunyao,WANGLei,ZHANGQiuxia,WANGYali,ZHANGJian,LONGJianfei,ZHAOHui*.

*School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing Key Lab of TCM Collateral Disease Theory Research, Beijing 100069, China

ZHAOHui,Email:zhaohui8957@sina.com

ObjectiveToobservetheinfluenceofcerebralhypo-perfusiononthelearningandmemoryabilityofrats,andtheultrastructureofpostsynapticdensity(PSD)andPSD-95proteinexpressionchanges.MethodsSDratswererandomlydividedintosham-operatedgroupandcerebralhypo-perfusiongroup.Thecerebralhypo-perfusionmodelwasproducedbypermanentbilateralcommoncarotidarteryligation.Learning-memoryfunctionexaminationwasassessedbyMorriswater-maze.Thenumberofsynapses,lengthandthicknessofPSDwereanalyzedbymeansoftransmissionelectronmicroscopycombinedwithImageProPlusimageanalysissystem.PSD-95expressioninbrainofrats’tissueswasobservedbyimmunohistochemicalstaining.ResultsTheswimdistanceforsearchingthehiddenplatformwasobviouslylongerincerebralhypo-perfusiongroup(P<0.05)incomparisonwithsham-operatedgroupinthefirst2-4daysofswimmingtrainingperiod.Afterthewithdrawaloftheplatform,thetimeandswimdistanceofcerebralhypo-perfusiongroupwerelessthanthesham-operatedgroupinthetargetquadrant.Thefrequencyofgoingthroughtheplatformcorrectlyalsodecreasedincerebralhypo-perfusiongroup(P<0.05).Whentheplatformwasmovedtothesecondandthirdquadrant,thedistanceforsearchingthemovingplatformwasobviouslylongerincerebralhypo-perfusiongroupcomparedwithsham-operatedgroup(P<0.05).Thenumberofhippocampalsynapsesalsoreducedsignificantlyincerebralhypo-perfusiongroup.TheactivitylengthandthicknessofPSDwereobviouslydecreasedincerebralhypo-perfusiongroup(P<0.05).TheintegratedopticaldensityofPSD-95inhippocampalCA1region,anteromedialthalamicnucleusandtemporalcortexweresignificantlydecreasedincerebralhypo-perfusiongroup.ConclusionsCerebralhypo-perfusioncanleadtolearning-memorydysfunction;itisrelatedtothedamageofpostsynapticdensestructureandthedecreaseofPSD-95expression.

cerebralhypo-perfusion；learningandmemory；postsynapticdensity；postsynapticdensityprotein-95

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.01.006

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30973782；No.81373526)；北京市自然科學(xué)基金資助項目(No.7122018)；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計劃-長城學(xué)者項目資助(CIT&TCD20140329)；北京市屬高等學(xué)校人才強(qiáng)教深化計劃“中青年骨干人材培養(yǎng)計劃”項目(No.PXM2011014226)

100069 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室

趙暉，Email:zhaohui8957@sina.com

R743.3

A

1006-2963 (2015)01-0020-06

2014-06-29)